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基因工程的相关热点

随着生物技术的飞速发展，曾经遥不可及的PCR技术逐步走进了高中实验室。PCR技术应用广泛，如实时荧光定量RT-PCR技术、重叠延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等，高考试题中有关PCR的问题越来越多，设问考查深度也明显提升。各种PCR技术不是孤立的，它们均已常规PCR为基础，为实现特定目的而进行了一定改进，但也有各自的局限性，因此在必要时可同时使用几种扩增技术，如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR等。

在高考备考中，要关注不同扩增技术的本质差异，同时总结此类试题的解题步骤；一是寻找题图有效信息，确定所考PCR类型；二是迅速再忆所考PCR的独特性，猜测出题人可能得意图；二是根据设问对前述猜测进行验证，并领悟出题人挖掘的新考点，进而对知识框架进行完善。

命题点：PCR技术与病毒检测、基因定点突变与基因改造、基因编辑技术、同尾酶等。

一、PCR技术及其应用

1、PCR技术与病毒检测——实时荧光定量PCR(RT－PCR)

新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。

RT(reversetranscription)-PCR即反转录聚合酶链反应，是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

（2）优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。

2、重叠延伸PCR技术

重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。

PCR扩增过程

高温变性：温度超过90℃，双链DNA解聚为单链

低温复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

中温延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链

3、大引物PCR技术

大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。

（1）引物设计需要遵循以下原则：

①引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

②引物序列在模板内应当没有相似性较高的序列，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

③引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

④引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

⑤引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

⑥ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。

⑦引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

⑧对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点。

4、反向PCR测定未知DNA区域

当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制