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By医药观察媛

分子生物学常用实验技术操作方法

目录

一、感受态细菌制备2

二、质粒转化.2

三、质粒提取.2

四、质粒转染.3

五、siRNA转染3

六、免疫印迹分析WB3

七、BCA蛋白定量4

八、细胞总mRNA提取4

九、Real-timequantitativePCR检测mRNA的表达5

十、免疫沉淀.5

十一、MTT法检测细胞增殖6

十二、细胞克隆实验6

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By医药观察媛

一、感受态细菌制备

取冻存Top10菌液冰上解冻，无菌吸取50µl至4mlLB培养

基中，放于摇床200rpm，37℃培养过夜。次日无菌吸取约40µl菌

液重新接种到4mlLB培养基中，继续孵育1~2小时。将菌液分装

转移至无菌2ml离心管中，冰上放置10~15分钟，4℃，3,000×

g离心5分钟收集菌体。弃去上清，用1ml预冷的100mM

CaCl2轻轻重悬细菌，冰上放置30分钟，4℃，3,000×g离心5

分钟收集细菌。弃去上清，加入100µl预冷的100mMCaCl2轻重

悬细菌，存于4℃，在12~24小时内使用；或加入灭菌的甘油，

使其终浓度为15%（v/v），保存于-80℃。

二、质粒转化

取10µl上述连接产物与50µl感受态细菌混合，冰上放置30

分钟，后放入42℃水浴中热激90秒，迅速取出放至冰上冷却2

分钟，加入500µlLB培养基，摇床200rpm，37℃培养1小时

使细菌复苏。6,000rpm离心5分钟，弃去上清，用100µlLB培养

基重悬细菌沉淀，用接种棒将菌液均匀涂抹在含有氨苄青霉素的固

体培养基上，在超净台中晾干，放在37℃培养箱中过夜培养。第二

天可挑取单菌落接种于4mlLB培养基中过夜培养，送样测序或加

入终浓度为20%的甘油冻存于-80℃

三、质粒提取

取-80℃冻存的菌液50µl或挑取培养皿中的单菌落接种于4

ml含有青霉素的LB培养基中培养8小时，接着扩增至50ml