噬菌体检测技术.ppt

一、噬菌体根底生物学;噬菌体本质;超过90%的噬菌体属于有尾噬菌体

其病毒子将近一半是双链DNA，另一半是蛋白质集合而成

带有二十面体的头部，交角五聚体，面六聚体

尾部形态分为三个科：60%为长尾噬菌体科，25%为短尾噬菌体科，15%为肌尾噬菌体科;根本噬菌体形态;“家庭照”：噬菌体?29和T2。

DwightAnderson提供电子显微照片。;噬菌体T4

数字表示基因编码的每种结构;生活方式有：烈性噬菌体〔virulent〕或温和噬菌体〔temperate〕

感染性噬菌体可以有选择地启动一个溶原性周期；而不是复制

溶原性状态是高度进化的结果，需要病毒和宿主共同进化，或许反映了两者的多方面优势，温和噬菌体可以帮助保护其宿主免受其它噬菌体的感染，可以引导有意义的宿主特征改变

较大的烈性噬菌体通常编码许多宿主致死性蛋白;噬菌体感染过程;穿透：不可逆吸附后，基因组通过尾进入宿主细胞，但不是实际意义的“注射”。噬菌体尾具有一种酶的机制来穿透肽聚糖层，然后接触或穿透内膜释放DNA直接进入细胞；尾的结合还会开发一种机制，一直阻碍DNA从衣壳出来的出口，直到完全定位到一个潜在的宿主细胞为止。;从宿主到噬菌体指导的代谢转换：起始步骤通常包括对宿主RNA多聚酶识别很强的噬菌体启动子，导致转录早早期基因。这些基因的产物可以保护噬菌体基因组和重建宿主适于噬菌体的需要；他们可以灭活宿主蛋白酶并阻碍限制性酶，直接终止各种宿主大分子生物合成，或破坏一些宿主蛋白。一组中期基因常常接着被转录，产生合成新噬菌体DNA的产物，随后是编码噬菌体颗粒成分的一组晚期基因。对有些噬菌体而言，这些转换包括合成新的σ〔sigma〕因子或DNA结合蛋白改编宿主RNA多聚酶；而另一些噬菌体编码其自身的RNA多聚酶。降解宿主DNA和抑制宿主mRNA的翻译是另外的一些机制，可以促使细胞改编合成新噬菌体。;形态发生：在多数噬菌体中，他们的装配涉及特异性的骨架蛋白和主要头部结构蛋白之间的复杂相互作用，随后蛋白水解分裂骨架蛋白和主要头部结构蛋白的N末端。在包装之前和包装期间，头部扩张并变得更稳定，伴有内部容积适合DNA的增加。位于头部的一个顶点是一个入口联合体，成为头部装配起始点、DNA包装酶入坞位点、通过DNA的一个管道、以及肌尾噬菌体和长尾噬菌体的噬菌体尾部〔被分开装配〕结合位点。;细胞裂解：是一种时机紧密受控的急促事件，如果裂解偶然过早，将很少会有新噬菌体会确保有效地继续这种周期；如果裂解延迟过久，重复感染和重复一个新爆发周期的时机将会丧失。有尾噬菌体都利用两种成分来裂解：溶细胞素〔lysin〕─能分解肽聚糖基质中的重要键的一种酶，以及控时蛋白〔holin〕─在膜内侧聚集有孔，在适当时机使溶细胞素作用肽聚糖层并促使裂解的一种蛋白。该时机受生长条件和遗传影响；改变裂解时机的突变能加以选择。;T4感染周期;二、噬菌体检测技术;引言;重组(信号)噬菌体;信号基因(如lux、ina、或gfp)被引入到噬菌体基因组和被包装到噬菌体颗粒中的重组DNA中。信号噬菌体与标本混合，但只感染敏感的宿主，免去了在测定前纯化生物的需要。随着感染，信号噬菌体基因组被复制，信号基因表达。一旦足够的信号蛋白积累了，表达的信号基因便能被检测。;噬菌体展示;肽文库片段作为与Fd噬菌体基因III(次要壳蛋白)或VIII(主要壳蛋白)融合的蛋白而被克隆。如果肽与基因III蛋白融合，只有很少的肽拷贝展示在噬菌体上，但可以形成功能性噬菌体，无须互补。如果肽与基因VIII蛋白融合，就必须在宿主细胞中反式提供野生性gpVIII，以便合成活性噬菌体颗粒，含有天然gpVIII和融合成肽序列的gpVIII的一种混合物。噬菌体文库暴露于联接到一种支持物的靶向配基，并且没有联接的噬菌体被清洗除去。结合了的噬菌体被提取出来并且生长为足够数量的具有所期望的键亲和力的噬菌体。利用更为严格的洗脱方式，重复该生物淘选过程，最终别离出具有最高键合亲和力的噬菌体。这些就是噬斑纯化和克隆插入序列分析。;二重噬菌体;在这种检测中，使用了两种转导性噬菌体，能转导对两种抗生素的耐药性基因到一个宿主细胞中。针对靶抗原的的抗体被化学性地结合到转导性噬菌体；如果使用针对靶抗原不同决定簇的抗体，就能增加这种检测方法的特异性。这种抗体标记的噬菌体与靶抗原混合并允许结合。标本与宿主细胞以适当的稀释比例混合，确保了随机共同感染宿主细胞是一件罕见的事件。被感染的宿主细胞铺板在含有两种抗生素的培养基上，从而选择出已被双重转导了的细胞。这仅仅发生在噬菌体结合到相同抗原颗粒密切聚集之处(琼脂平板上的菌落代表一个阳性结果)。;噬菌体扩增检测;这种检测方法需要的是非修饰的噬菌体。靶细菌的噬菌体与标本混合并允许感染易感