蛋白质和多肽的氨基酸序列测定.ppt

关于蛋白质和多肽的氨基酸序列测定蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级结构的信息也有助于对其基因结构的研究。目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来；②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍采用，可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色谱进行分离分析。本章将就蛋白质和多肽的N端、C端氨基酸序列分析的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。第2页,共22页，星期六，2024年，5月第一节N端分析原理一、耦联蛋白质和多肽的自由α—氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。第3页,共22页，星期六，2024年，5月二、裂解在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的α—氨基，又可与PITC进行耦联反应。第4页,共22页，星期六，2024年，5月三、转化ATZ—氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25％)中可转化成稳定的PTH—氨基酸。第5页,共22页，星期六，2024年，5月第6页,共22页，星期六，2024年，5月四、PTH—氨基酸的鉴定可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。通常选用C—18反相柱进行分离。第7页,共22页，星期六，2024年，5月第二节N端蛋白质序列仪三、气相序列仪自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为1～2mg。1978年Tarr等将一种四级铵盐聚合物“polybrene”引入了蛋白质、多肽的序列测定，它能和肽链中的极性基团作用(非共价键合)而将蛋白质和多肽有效地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子生物学对蛋白质微量分析的要求，20世纪80年代初，Hewick及Hunkpillar等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型玻璃反应室(内部体积约0.05m1)代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用polybrene固定样品，Edamn降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式输送，其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列仪具有以下明显优点：①灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需50～100pmol；②试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的l／10，降低了费用；③缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。20世纪80年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性PVDF膜的问世，蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行固相序列分析。第8页,共22页，星期六，2024年，5月在这两种序列仪中，Edman降解后的PTH—氨基酸衍生物可及时直接从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行PTH—氨基酸衍生物的定性及定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图4.2为标准PTH—氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在20min内将各组分较好分离，需选择合适的色谱条件，表4.1列出了各种条件的改变导致个别组分位置的迁移及图谱的改善。第9页,共22页，星期六，2024年，5月第10页,共22页，星期六，2024年，5月第三节影响N端Edman反应裂解率的因素在测序中往往可以发现，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是由于Edman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为95％～98％。因此，经过50次循环后，