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第十四章

基因诊断和基因治疗;

讲授内容及要求

一、基因诊断的基本概念

二、基因诊断的基本技术

三、基因诊断的应用

四、基因治疗:概念、方式、

程序、应用

;第一节基因诊断基本概念和流程;传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断;基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义;

二、基因诊断的特点

针对性强：以探测疾病基因为目标，属于“病因诊断”。

特异性高：以分子杂交技术为基本原理

灵敏度高：基因探针带有十分敏感的检测标记，可从人

类长达3×106kb的基因组中检测出某一基因的

单碱基改变。而且待测标本微量。

;早期诊断：基因诊断不仅可对有表型出现的疾

病作出明确诊断，它还可在产前早期

诊断遗传性疾病，可检出感染疾病潜

伏期的病原微生物、还可预测和早期

发现某些恶性肿瘤。;样品抽提;第二节基因诊断的基本技术;一、核酸分子杂交（hybridization）

这是应用最广泛的一类基因诊断技术

根据碱基互补配对原则，将样品DNA/RNA双链经变性处理，加入已标记的单链DNA/RNA探针，样品中与探针互补的DNA/RNA序列可与探针形成杂交双链DNA，通过显示标记物或其它方法来检测特定的核酸片段。

;分子杂交技术过程

☆探针制备及标记（同位素或非同位素）

☆待测核酸样品制备（分离，纯化）

☆杂交（液相，固相）

☆杂交后处理（去掉非特异杂交分子）

☆显示结果（显色，发光，放射自显影）

☆结果分析;分子杂交的基本方法

原位杂交

斑点印迹杂交

Southern印迹杂交

Northern印迹杂交

;（一）原位杂交;（二）斑点印迹杂交

把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与标记核酸探针杂交。通过纤维素膜杂交斑点的放射自显影或胶片斑点的光吸收值扫描可以测定待检核酸的含量。

可检测特定基因的存在或表达情况。;(三)Southern印迹杂交

1975年，英国Southern创建

概念:将制备的DNA经酶切电泳、再转印到固相支持物上，用探针杂交后进行检测的方法，用于DNA/DNA杂交。

该方法主要用于检测基因组中待测的基因或序列;(四)Northern印迹杂交

检测RNA（主要是mRNA）的方法

与Southern杂交的不同

靶核酸：RNA

RNA电泳

Northern印迹杂交主要用于观测各种基因转录产物的大小、转录量以及转录产物特性分析。;总RNA/mRNA→变性电泳分离→转移→杂交→放射自显影/化学显色;二、PCR技术;通过PCR能扩增出所需的特异性条带;PCR的原理;标准的PCR反应体系;三、限制性片段长度多态性（RFLP）:

限制性核酸内切酶能够识别特定的DNA序列，并在其中的某一特定碱基位点（限制性位点）将DNA切断，使DNA形成限制性片段.

;RFLP技术珍断疾病的机理:

由于基因突变的结果,使DNA上原有的核酸内切酶的识别序列发生改变,导致使用限制酶去切割时得到的结果与不发生突变的结果完全不同,可借此做出诊断.

如:某些遗传性疾病发生特异的点突变,而点突变位置正好是某些酶的识别和切割点,可用酶切方法做出诊断.;RFLP的主要步骤

DNA→酶切→Southern杂交分析

DNA→PCR→酶切→电泳分析;点多态性

表现为DNA链中发生