基因诊断与基因治疗【43页】.pptxVIP

生物化学暨分子生物学教研室关亚群基因诊断与基因治疗Genediagnosis

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GeneTherapy

第一节基因诊断基因诊断—以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。基因诊断方法主要用于诊断下列两种类型疾病1.内源基因的变异基因结构的异常(点突变、插入、缺失、重排、异位)基因表达的异常2.外源基因的插入

基因突变的诊断点突变的诊断①诊断已知的点突变（PCR/ASO）②诊断未知的突变PCR/SSCP/测序DNA芯片技术少数核苷酸缺失或插入的诊断大片段丢失或插入的诊断(PCR/多重PCR)基因重排（染色体易位）的诊断基因扩增的诊断

多态性连锁分析DNA多态性标记限制性片段长度多态性（RFLP）DNA→酶切→Southern杂交分析DNA→PCR→酶切→电泳分析短串联重复序列（shorttandomrepeat,STR）单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）

基因表达异常的诊断mRNA的相对定量分析斑点杂交或狭缝杂交RT-PCRmRNA的绝对定量分析RT-PCR/竞争性PCRmRNA长度分析Northern杂交/RT-PCR产物电泳外源DNA检测核酸分子杂交PCR技术

基因诊断的原理和方法一、基因诊断的原理DNA诊断----检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。RNA诊断----对表达产物mRNA质和量表达的分析。

基因诊断的原理和方法二、基因诊断中常用的分子生物学方法（一）核酸分子杂交（二）PCR（三）SSCP（PCR-SSCP）（四）DNA分子多态性分析（五）限制性核酸内切酶酶切图谱分析（六）DNA序列测定（七）DNA芯片技术

基因诊断中常用的分子生物学方法（三）PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）单链构象多态性（Singlestrandconformationpolymorphism，SSCP）是诊断未知点突变常用的检测方法之一。单链DNA在中性溶液中可形成一定的空间构象，这种空间构象与其碱基顺序相关。因此当单链DNA中碱基发生变异时，如碱基替换，它的空间构象也发生一定变化。这种单链DNA因碱基变异而引起的空间构象变化的现象称为单链构象多态性。

基因诊断中常用的分子生物学方法（三）PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率不仅与链长有关，还与单链DNA的空间构象有关，因此碱基变异引起的构象变化也可改变单链DNA的电泳迁移率。利用这种原理可将野生型DNA和突变型DNA区分开来。PCR-SSCP的基本方法制备DNA样品PCRPCR产物热变性、快速冰浴非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示结果

ssDNAdsDNAdsDNA高温变性，快速冰浴dsDNAssDNA野生型DNA突变型DNASSCP原理示意图慢快

基因诊断中常用的分子生物学方法（四）DNA分子多态性分析由于DNA分子突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失，可使人类基因组DNA产生大量的中性突变。基因组的核酸分子碱基排列顺序在同种生物的不同个体之间或等位基因之间存在差异的现象称为基因多态性。DNA多态性可分为位点多态性和重复序列多态性。

基因诊断中常用的分子生物学方法（四）DNA分子多态性分析1.限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析DNA分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可使某种限制性核酸内切酶的酶切位点消失或出现新的酶切位点，因此用同一种限制性核酸内切酶消化不同个体的DNA分子时，会产生各不相同的限制性片段类型。这种现象称为限制性片段长度多态性。

基因诊断中常用的分子生物学方法限制酶酶切位点的改变造成的RFLP可分为两种情况：①限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致酶切位点消失或获得，称为位点多态性。这种多态性只有两个等位片断，即多态位点的有或无。②限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，限制酶识别序列不发生变化，但它在基因组中的位置发生了变化。这种多态性可以有两个或两个以上的等位片断。

基因诊断中常用的分子生物学方法RFLP分析法限制酶酶切图谱直接分析法