海城市宠物犬沙门氏菌携带情况调查与耐药性分析.docx

海城市宠物犬沙门氏菌携带情况调查与耐药性分析

沙门氏菌是杆状的革兰氏阴性兼性厌氧菌，属于肠杆菌科，是一种非常重要的人畜共患疾病。目前，国内外已有大量关于人源、鸡源、猪源、食源、沙门氏菌耐药性的研究，宠物犬源沙门氏菌耐药情况国内鲜有报道。目前，我国宠物数量不断增加，人与宠物之间的依赖关系也日益凸显。宠物行业的快速发展，愈来愈多的兽用甚至是人用抗生素被用于宠物疾病的预防和治疗。然而，随着抗生素的广泛应用，沙门氏菌的耐药性也愈来愈严重，这不仅影响临床治疗效果，而且由于人与宠物的密切接触，增加了耐药细菌传给人类的风险。本研究采用PCR技术对海城市宠物犬肛门棉拭子进行分离鉴定，并确定分离株的血清型；Kirby-Bauer纸片扩散法(K-B)测定宠物犬源沙门氏菌分离株对临床常用药物的敏感性，并测定blaOXA、sul2、gyrA、gyrB、floR、tetA和tetC基因，了解锦州地区宠物犬携带沙门氏菌的情况，并从基因水平结合表现耐药进行药物敏感性分析，为锦州地区宠物犬临床用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源犬源沙门氏菌，采自辽宁省海城市宠物门诊宠物犬肛门棉拭子。

1.1.2主要培养基和试剂缓冲蛋白胨水（BPW）、普通琼脂培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。药敏纸片购于上海化科实验器材有限公司。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1样本的采集2018年5～12月，于海城市6家宠物医院随机共采集健康犬82份和患病犬209份，总291份犬肛棉拭子样品。

1.2.2细菌分离、鉴定无菌操作把肛门棉拭子放入到5LBPW增菌液中37℃，培养18h。轻轻摇动培养过的样品混合物使其均匀，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18～24h。取过夜培养的菌液，按照DNA提取试剂盒说明提取细菌组总DNA作为模版。参照文献[1]合成沙门氏菌引物，invA（5’→3’）：F:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA，R:TCATCGCACCGTCAAAGGAACC，片段长度为285pb。

PCR反应体系为25μL：BufferMix12.5μL，dNTPs5μL，上下游引物各1μL，ddH2O调整总体积25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.2.3血清型鉴定依文献合成我国报道的主要沙门氏菌血清型（O抗原中B、C1、D和E1及鞭毛H抗原H1相和H2相）引物，O抗原（5’-3’）：B群：F:GCGATTAGAGCATGTATATGGR:CAGTTCCAACTTGATACTCAGT，片段大小为216pb；C1群：F：GACATGACTTTGAAATCGGGTA；R:ATTCCTACACGCACTAATACTG，片段大小为760pb；D群：F:GGTAAACTTATCGTCTCCATCA；R:CTTAGCAAGGAAGAGGAACAAT，片段长度为385pb;E群:F:CTTTGCTGAGCTAGGTATAAGTA，R:GCTATTCAAAGACGCTGTATATC，片段长度为1323pb。H抗原(5’-3’)：H1相：F:TGACCCAGAATAACCTGAAC，R:TAACGCAGTAAAGAGAGGAC，片段长度为1450pb；H2相：F:ATGGCACAAGTAATCAACAC，R:TAGTCGGAATCTTCGATACG，片段大小1409pb。

PCR反应体系为25μL，各组分如下BufferMix12.5μL，dNTPs5μL，上下游引物各1μL，ddH2O5.5μL。PCR反应条件：扩增循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。扩增结果经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统观察结果。

1.2.4药敏试验采用K-B琼脂法检测分离菌对常用16种抗菌药物进行药物敏感性试验。

1.2.5耐药基因检测参照文献合成检测沙门氏菌5大类抗生素7种耐药基因PCR引物序列（5’-3’）。B-内酰胺类（blaOXA）：F：ACACAATACCATATCCAACTTCGC，R:AGTGTGTTTAGAATGGTGATC，产物大小876bp。四环素类（TetA）：F:TACGGG