双脱氧末端终止测序法原理-过程和目标基因cDNA序列拼接和分析.ppt

双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析;实验目的;DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期创造的。

A.双脱氧链终止法〔thechainterminationmethod〕，是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。

B.化学降解法〔chemicaldegradationmethod〕，是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记进行测序。;1.Sanger双脱氧链终止法测序原理;根本原理：

聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；

利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。;6;2、具体操作：;同理第二个反响产生的都是以C结尾的;第三个反响的都以G结尾,第四个反响的都以T结尾,电泳后就可以读出序列了.;假设有一个DNA,互补序列是GATCCGAT,我们试着做一下:;制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到别离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。

;制备单链模板

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将单链模板与一小段引物退火

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参加DNA多聚酶4种脱氧核苷酸

分别参加少量4种双脱氧核苷酸

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将4种反响产物分别在4条泳道电泳

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根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列

;4、高通量自动化测序;自动化测序原理;高速自动DNA测序仪的结构及工作原理;荧光化合物标记链终止法以荧光颜色为标记信号，每种ddNTP各有1种代表颜色；整个反响在一个试管中进行；当新合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。;16;Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力：

?手工测序：最大约300bp；

?自动测序：最大约1200bp。;二、序列比对分析;同源性(homology)：

指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。就是说A和B的关系上，只有是同源序列，或者非同源序列两种关系。而说A和B的同源性为80％都是不科学的。;序列的相似性和序列的同源性有一定的关系，一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似性来推测序列是否同源。

正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源性为80％一说。;序列相似性比较：

就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等；;序列同源性分析：

是将待研究序列参加到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包有CLUSTAL等；;2.Blast简介及应用;Blast是一个序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据查询的对象和数据库的不同来定义的。比方说查询的序列为核酸，查询数据库亦为核酸序列数据库，那么就应该选择blastn程序。

下表列出了主要的blast程序：;主要的blast程序;〔2〕Blast资源;Blast结果会列出跟查询序列相似性比较高，符合限定要求的序列结果，根据这些结果可以获取以下一些信息：

1.查询序列可能具有某种功能；

2.查询序列可能是来源于某个物种；

3.查询序列可能是某种功能基因的同源基因；

…

这些信息都可以应用到后续分析中。;〔3〕Blast应用;Blast任务提交表单1;Blast任务提交表单2;Blast任务提交表单3;提交任务;结果页面1;结果页面2;结果页面3;〔4〕一个例子;具体步骤：;1.登陆ncbi的blast主页;3.填入序列〔copy＋paste〕

Fasta格式，或者纯序列