质谱技术在抗体药物分析中的应用.docxVIP

??

?

??

质谱技术在抗体药物分析中的应用

?

?

?

?

?

??

?

?

?

关键词：抗体药物质谱一级结构高级结构

单克隆抗体药物的发展起源于1975年，Kohler和Milstein创立杂交瘤技术，为大量制备鼠源单克隆抗体提供了技术条件，开创了大规模制备单克隆抗体时代。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物，可以和靶抗原特异性结合，并且更加安全有效，所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的发展，是当前生物药物领域增长最快的一类药物。[1]

1.抗体药物发展新趋势

在生物药物领域，抗体药物占据着越来越重要的地位，2015年全球销售排名前10位的药物中有6个为抗体药物，分别是humira、enbrel、remicade、rituxan、avastin和Herceptin。抗体药物按来源分类可以分为：鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。鼠源单克隆抗体是第一代的抗体药物，经过不断改造过渡到全人源单抗。目前，FDA批准的单克隆抗体药物中，人源化单抗和全人源单抗数量已占据72%[2]

1.1抗体药物偶联物（ADC）

抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成，小分子化合物通常是毒性很强的抗肿瘤小分子药物。通过抗体的靶向作用，ADC的抗体部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合，通过细胞内吞作用，将抗体和小分子化合物一起带进肿瘤细胞内部，并在细胞内部发生水解反应，释放出小分子化合物，从而杀死肿瘤细胞。[3]这样既可以降低小分子药物的毒性，同时具有靶向结合的作用。已经上市的两个ADC是Kadyla和Adcetris。

1.2双特异性抗体（BsAb）

双特异性抗体（BsAb）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，现已成为抗体工程领域的热点。由于基因工程的发展，目前双特异性抗体已经研发出多种类型[4]，主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体(串联scFv)、DVD-Ig等多种形式。2014年第一个双特异性抗体Blinatumomab获FDA批准，靶向位点是CD19和CD3。

2.质谱技术

近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术：一种是介质辅助的激光解吸/离子化(matrix-assistedlaserdesorption/ionization.MALDI)[5]技术。另一种是电喷雾离子化（Electrosprayionization，ESI）[6]技术。由于这两种电离技术的出现，使原本只能检测小分支的质谱技术，可以运用于检测生物大分子。

MALDI和ESI两种离子化方法都是软性离子化法，能够使生物大分子在离子化过程中的保持完整性，分析灵敏度都极高，对低浓度的生物大分子样本也有很好的检测效果。目前，高效液相色谱电喷雾质谱仪联用（HPLC-ESI-MS）及飞行时间质谱仪(HPLC-ESI-TOF)联用已成为蛋白质组学实验中最常用的质谱技术。通过质谱技术可以得到肽指纹图谱，并通过与二维电泳的联用分析蛋白质。现在这项技术越来越多的应用于抗体药物分析中。与其它抗体方法相比，质谱分析具有准确性高、灵敏度高、分析时间短和应用范围广的优势，但是由于质谱仪器高额的成本限制了其发展。

在过去质谱技术主要运用于对一级结构和序列的表征，而现在质谱技术越来越多地运用于高级结构的分析，而高级结构对于抗体药物的生物活性至关重要。过去只有对于小分子药物，质谱可以进行定量分析，对于大分子蛋白只能够进行定性分析，而现在生物质谱不断发展，现在已经可以进行半定量分析，相信在不久的未来生物大分子的定量分析也可以实现。

3.质谱技术在抗体药物一级结构分析中的应用

3.1完整抗体药物精确分子量测定

当得到抗体药物时，可以直接通过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS进行分子量的检测。通过对于脱糖后分子量的检测，可以对于抗体药物进行初步定性分析，并将可以作为药物常规放行的分析方法[7]。对于脱糖前的抗体药物进行分析，可以得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化水平的分布[8]，对于快速了解生产工艺与药物质量的关系具有十分重要的意义。该方法可以对于样品的分子量进行快速检测，适用于工艺过程样品的快速检定。

3.2药物抗体偶联比（DAR）

对于赖氨酸链接的抗体偶联药物，采用C4色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析，根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目[9]。对于半胱氨酸链接的抗体偶联药物，利用反相色谱(RP-HPLC)串联质谱，测定药物抗体偶联比(DAR)[10]。对于质谱测定的结果，不仅可以给出确切的药物抗体偶联比值，更能够给出链接不