荧光定量技术临床应用.ppt

全血以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA第32页,共52页，星期六，2024年，5月外周血单个核细胞外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70℃下第33页,共52页，星期六，2024年，5月痰痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理，即用1mol/LNaOH或变性剂液化如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下第34页,共52页，星期六，2024年，5月棉拭子在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取,则需保存于-70℃下.第35页,共52页，星期六，2024年，5月脓液脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗2～3次后,即可用于DNA提取对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。沉淀标本的保存条件同样为-70℃第36页,共52页，星期六，2024年，5月体液临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。第37页,共52页，星期六，2024年，5月乳汁乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。提取方法：乳汁标本置4℃冰箱过夜→取100ul中清液→10000rpm/min离心10分钟→尽可能去除奶酪（建议用棉签蘸去）→弃上清加50ulDNA提取液→沸水浴10分钟→10000rpm/min离心5分钟→取5ul上清点样扩增。第38页,共52页，星期六，2024年，5月组织组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%.这样固定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取第39页,共52页，星期六，2024年，5月临床标本中PCR反应抑制物内源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。外源性的:如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。第40页,共52页，星期六，2024年，5月常见的核酸提取方法煮沸法柱提取磁珠法一步法二步法裂解方法煮沸煮沸化学裂解化学裂解分离方法离心离心亲和吸附吸附或杂交步骤煮沸裂解离心，去除大分子的抑制物取上清扩增煮沸裂解离心弃上清，浓缩标本并去除小分子抑制物离心，取上清扩增，去除大分子抑制物。化学裂解过柱吸附洗涤洗脱取洗脱液扩增化学裂解加磁珠吸附洗涤洗脱取洗脱液扩增抗干扰能力差较差好最好提取物组分较小分子量的混合物与核酸相似分子量的混合物全核酸特定病原的核酸自动化程度手工手工手工或自动半自动或全自动第41页,共52页，星期六，2024年，5月第42页,共52页，星期六，2024年，5月RNA提取的独特性临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活。如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在。第43页,共52页，星期六，202