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激光扫描共聚焦显微镜原理及实际应用

摘要激光扫描共焦显微镜在生物医学和材料科学的研究中日益受到重

视，它以一种非侵入式的、对活体无损伤的检测手段，得到了多方面的欢

迎和越来越广泛的灵活应用。LSCM是细胞神经生物学和生理学，药物学

及遗传等生物医学领域的新一代研究工具。在对有机组织分层扫描后得到

的“光学切片”经过三维重建后，能够测量分析出细胞形态参数和荧光强

度等等。因此本文阐述了LSCM的原理及其功能，并说明其实际操作方法。

关键词：激光扫描共焦显微镜原理功能实际操作

激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是20世纪80年代发展起来的，是当今世界上最先进的

[1]

分子生物学分析仪器之一。1969年,Dvadiiuzit等提出了共焦扫描显微镜,其作原理与飞点扫

描显微镜相类似,即右激发光路方面,以聚焦的激光光斑作为光源。但在探测光路方面，样品

的反射光或透射光通过一个透镜聚焦到一个空间滤器上，再由探测器进行信号采集和转换,

这样探测光路仅仅探测来自物空间某特定区域的光线，使得光学系统的空间分辨率得到人人

的改善，并同时减小了系统的焦深,从而使得有可能对生物组织进行光学断层扫描成像。即

是在传统荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外线或可见光激发荧光探针，

利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水

[2]

平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。

LSCM具有快速、实时、定性、定量、定位的进行分析测量的功能，尤其是可进行活细

胞的无损伤测定，利用强大的计算机图像处理技术将一定厚度范围内的细胞或结构的虚拟光

学切片进行三维重塑工作，再现细胞或组织的微细三维结构。

1原理

激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作

光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一

点进行扫描。组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射

光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探

测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像（图1）

在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探

测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。

由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与

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探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光作光源并对样品进

行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜

图1激光共聚焦显微镜原理

2应用

激光共聚焦显微镜与传统显微镜相比，具有高分辨率，高灵敏度，高放大率等特点，在

细胞水平上可做多种功能的测量和分析，可得到真正具有三维分析的图像。同时，还可处理

活的标本且不会对其造成物理化学的损害，随着软件的开发和应用技术的不断完善，激光共

聚焦已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等科学中新一代强有力的

研究工具[3]。

2.1原位鉴定组织或细胞内生物大分子，观察细胞及亚细胞形态结构

2.1.1原位检测细胞的核酸

激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特