新生乳鼠原代海马神经细胞体外培养、鉴定及KA对其存活率影响的研究.docxVIP

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新生乳鼠原代海马神经细胞体外培养、鉴定及KA对其存活率影响的研究

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基金项目：湖南省教育厅研究项目（湘教通[2012]596号，12C0508）

摘要目的：探讨改良的新生乳鼠原代海马神经细胞体外培养方法，建立稳定方便的神经细胞体外培养方法，探索KA在体外对海马神经细胞存活率的影响。方法：采用新生24h以内的SD乳鼠，分离海马后，不用机械剪碎组织块，直接用胰蛋白酶进行消化后，用含血清的DMEM+B27培养液制成细胞悬液进行接种，接种24h换用无血清Neurobasal+B27持续培养。选用海马神经细胞特异抗体MAP2通过免疫荧光法鉴定细胞纯度。用MTT测相对存活率，研究KA在体外对海马神经细胞的致死效果。结果：接种24h后细胞完全贴壁，并长出突起，之后突起延长交错成网络，7~8天神经细胞达到成熟顶峰，之后逐渐老化，21天后老化已非常明显。海马神经细胞纯度达96%以上。KA在体外同样能有效诱导海马神经细胞死亡，4、8h时间对比效果明显，2、12、24h差异不大。结论：改良的方法能稳定便捷地在体外培养神经细胞，细胞纯度好，可用于神经疾病体外研究。KA受体在体外同样能被KA激活，诱导细胞死亡，相关后续研究可进行体外实验，最佳研究时间在给药后4~8h。

关键词KA；海马神经细胞；体外培养；乳鼠

细胞凋亡，又称为细胞程序性死亡，是指细胞由于其内部程序激活而发生的自杀性死亡[1]。海马是中枢神经系统重要的功能部位，神经细胞原代培养是体外研究神经系统疾病的重要手段之一，也是对神经系统损伤进行细胞分子水平研究的基础。因此，建立稳定方便的神经细胞体外培养方法，对研究神经系统疾病，特别是在研究神经细胞损伤和修复中的作用尤为重要[2]。在海马神经细胞分离培养过程中，突出的难点集中在取材难度较大，以及培养基中血清的影响，杂质细胞极易混杂，影响了海马细胞的培养和纯度[2,3]。我们参考国内外海马细胞培养、分离的经验，对其关键步骤予以优化，建立了一种改良新生乳鼠海马神经细胞的体外培养方法。这一改良的新生乳鼠海马神经细胞体外培养方法，可为缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病研究，提供良好的神经细胞体外研究基础。

红藻氨酸（kainicacid,KA）是从海人草中提取的一种谷氨酸类似物，具有明确的神经兴奋和神经毒性。研究表明KA可通过激活相关受体如KA1、KA2、GluR5、GluR6、GluR7导致神经细胞凋亡，相关研究在神经退行性病变疾病的研究中已经受到重视[4]。为排除体内因素的干扰，我们借助采用改良方法培养出的新生乳鼠海马神经细胞，进行体外给药研究，探索KA对体外培养神经细胞存活率和形态的影响，探讨KA受体在细胞凋亡中的作用。

1.材料与方法

1.1海马神经细胞体外培养

1.1.1实验动物

出生24h内新生健康SD大鼠，由长沙医学院基础医学院提供，清洁级，雌、雄不限。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。

1.1.2主要设备

超净工作台（江苏苏净），CO2培养箱（美国ＴThermo公司），恒温水浴箱（杭州博日），倒置相差显微镜（日本Olympus），激光共聚焦显微镜（日本Nikon）。

1.1.3方法

主要试剂配制：0.01%多聚-L-赖氨酸溶液（PLL，Sigma公司），0.2μ过滤除菌。②细胞培养液1（接种用）[2,3]：高糖DMEM（Hyclone）88%、B27（Gbico）2%、胎牛血清（杭州四季青）10%。③细胞培养液2（持续培养用）[2,3]：Neurobasa（Gbico）98%、B272%。④0.25%胰蛋白酶液（Biodder），0.2μ过滤除菌（Sigma）。

细胞培养瓶、盖玻片预处理：用0.01%的PLL2.5ml包被覆盖细胞培养瓶瓶底，4℃过夜。使用前PBS清洗3次。盖玻片高强度H2SO4溶液中浸泡过夜后洗净，高温高压灭菌，置于12孔板内，后续处理同培养瓶。

海马细胞原代培养：①取材：取24h内新生SD乳鼠，75%酒精消毒后，断头取脑置于预先冰浴处理的Hank’s平衡盐溶液（Hank’sbalancedsaltsolution，HBSS）中。冰上分离出新生SD大鼠的双侧海马，剔除血管和筋膜。②消化：加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴振荡消化10~15min，待组织成粥糜状，加少量血清终止消化，吸去胰蛋白酶，用HBSS洗2次。③吹打及过滤：加入细胞培养液1（含10%胎牛血清）吹打成无肉眼可见组织颗粒的细胞悬液，经200目滤网过滤，800~1000r/min离心，用细胞培养液1重悬，制成单细胞悬液。④接种：细胞悬液调整细胞密度至8×10

5个/ml接种于细胞培养瓶中。24h后全量更换为细胞培养液2（不含血