免疫组织荧光染色法实验操作流程.pdf

MBP免疫荧光染色（石蜡切片）

操作步骤时间备注

脱蜡60℃恒温箱烘烤20min烘烤后立即放入新鲜的二甲苯中

二甲苯Ⅰ15min脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分，每次换液前甩干洗涤液，但要防止干片。

时间要灵活掌握，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话要适当延长脱蜡时间。

二甲苯Ⅱ15min

水化100%乙醇Ⅰ5min

100%乙醇Ⅱ5min

95%乙醇2min

90%乙醇2min

80%乙醇2min

70%乙醇2min

蒸馏水（浸洗）3*2min

抗原高压锅柠檬酸盐缓3min先将柠檬酸盐缓冲液加到洗盒里，加热高压锅，待柠檬酸盐缓冲液升温至60℃左右时放入水化后的

修复冲液标本，盖好高压锅，不加压力阀。加热高压锅，待压力阀处冒水蒸汽时，盖上压力阀，加热三分钟。

压力降到正常大气压后打开锅盖，待玻片自然冷却。

自然冷却

封闭蒸馏水洗2*3minⅠ抗为兔抗鼠，Ⅱ抗就应该为**抗兔，所以我们封闭时选用被抗最少的物种，一般选用牛血清或者

驴血清。再封闭时，为了防止封闭液流失，可以用pad笔在标本周围画圈，提高液体的利用度。

0.3%PBST浸洗2*5min

5%驴血清封闭室温1h（PBS配）

加Ⅰ抗0.3%PBST浸洗2*5min在加Ⅰ抗的时候，要用吸水纸吸干周围的水，用pad笔画圈，防止Ⅰ抗流失，影响效果。

BRIT1抗体4℃过夜

加Ⅱ抗0.3%PBST浸洗2*5min室温下1h，注意要避光。如果需要进行双标，在从封闭开始进行，

驴抗兔4881h

封片1×PBS浸洗3*5min因封片液中含有DAPI染细胞核（蓝色），所以不用做核的染色。

含DAPI的封片液封

片

冰冻切片（贴片）

操作步骤（贴片）时间备注操作步骤（漂片）时间备注

标本-80℃保存标本保护液-20℃保存漂片最好要20um

复温室温10min复温PBS洗（24孔板）3*5min摇床

固定4%PFA固定30min

破膜PBS洗3*10min破膜1%PBST20-30min

1%PBST破膜15-20min