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免疫荧光技术的实验方法及其分类

一、免疫标记法及其分类

1.荧光免疫法

原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形

酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min

内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表达(△Mb)表达。该法反

复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。

以双抗夹心法为例，一方面将特异性抗体与固相载体连接，形成

固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与

固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标

记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。

最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。

传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测

定法是以具有专长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后

激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

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2.放射免疫法

放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞

争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的

抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过

离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其

放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。

RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准拟定量到ng/ml

水平。但初期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，

随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为

简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。

3.酶联免疫法(ELISA)

ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb

和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建

立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1000ug/L。夹心ELISA

法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异

性强，精密度好，操作简朴，合用于多份标本的检测，不需特殊仪器

设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。

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以双抗法为例。一方面包被抗原，然后加入一抗，使一抗与包被

抗原形成抗原—抗体复合物。接着加入酶标二抗，形成抗原—抗体—

抗体复合物。最后加入底物，由酶催化底物生成产物。通过产物的生

成量即可对蛋白抗原进行定量。

4.偶联生物素—亲和素系统的酶免法

运用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性，使传

统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。

5.时间分辨荧光免疫分析

时间分辨荧光免疫分析(TimeresolvedFluorimmunoassay，TRFIA)

是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据

镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波

长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，

极大地提高了分析灵敏度。

6.解离增强镧系元素荧光免疫分析

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解离增强镧系元素荧光免疫分析(DissociationEnhanced

LanthanideFluorimmunoassayDELFIA)是时间分辨荧光