07第五章 分子生物学研究方法.pptVIP

5·1重组DNA技术史上的重大事件三、基因克隆的主要载体系统基因载体应具备的条件：（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；（2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；（3）有一定容量；（4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。小结5·2·2PCR技术PCR技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n个DNA分子。PCR技术的原理首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动(“引导”)新链的合成，所以，新合成的DNA链的起点是由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点决定的。5·2·3cDNA噬菌粒文库1、高质量mRNA的制备小结1、细菌转化2、聚合酶链式反应（PCR）技术3、cDNA噬菌粒文库4、基因敲除技术Gateway克隆技术在λ噬菌体特异位点重组系统的基础上进行一系列修饰、改造，提高了这一重组系统的效率与特异性。Gateway克隆技术主要包括TOPO反应和BP－LR反应。小结1、RACE技术2、应用cDNA差示分析法克隆基因3、基因的大规模克隆技术4、酵母单杂交法5、酵母双杂交系统课后复习题1、名词：基因工程、蓝-白斑筛选、细菌转化、克隆。2、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？3、基因载体应具备那些条件？4、PCR的反应体系要具有什么条件？5、举例说明差式筛选组织特异cDNA的方法？6、简单叙述RACE技术的基本步骤7、比较完全型基因敲除和条件型基因敲除的异同。8、简单说明酵母单杂交技术的原理。检测方法小结1、基因表达系列分析技术2、RNA选择性剪切3、原位杂交技术4、定点突变技术5、RNAi技术微阵列芯片制作的主要过程：1、经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段；2、用机械手将PCR产物点在玻璃板上，变性、固定；3、分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成cDNA；4、分别用Cy3（绿色）和Cy5（红色）两种荧光燃料标记两种cDNA;5、将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交；6、激光扫描芯片杂交结果，计算机处理；7、分析杂交数据。双向电泳（twodimensionelectrophoresis，2－D）是分离混合蛋白质最常用的方法。双向电泳由两部分构成：等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。该方法是依赖于蛋白质的等电点的不同和相对分子质量的不同而构建的。凝胶阻滞试验（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。是分离纯化特定DNA结合蛋白质的经典方法。原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加分子量，而凝胶电泳中DNA朝正极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比，因此，没有结合蛋白质的DNA片段跑得很快，而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而跑得慢。当特定DNA片段与细胞提取物混合后，若复合物在凝胶电泳中的迁移率小，就说明该DNA可能与提取物中某个蛋白质分子发生了相互作用。由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白质可逆磷酸化过程，是生物体内一种普遍且重要的调节方式，控制着众多的生理生化反应和生物学过程。细胞的生长发育、形态形成、细胞周期调控、基因表达、蛋白质合成以及神经功能、肌肉收缩等都离不开蛋白质特异性磷酸化。小结1、双向电泳技术2、蛋白质免疫印迹实验3、凝胶阻滞试验(EMSA)4、噬菌体展示技术5、免疫共沉淀技术6、蛋白质磷酸化分析课后复习题1、基因表达系列分析技术的原理是什么？简单叙述SAGE的操作方法。2、PCR介导的基因定点突变技术与传统的基因突变方法相比有什么优点？3、RNAi技术与基因敲除技术相比有什么优点？4、简单叙述微阵列基因芯片制作方法。5、双向电泳技术是根据蛋白质的什么特性设计的？6、总结蛋白质与DNA相互作用的研究方法，比较其优缺点。/生物通生物谷《现代分子生物学实验技