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基因重组与基因工程
Generecombination
andgeneticengineering
孙庆涛刘华明
2021.3.16
整理课件
重组DNA技术又称为基因工程〔genetic
engineering〕或分子克隆〔molecular
cloning〕。
基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：
①载体和目的基因的别离
②载体和目的基因的切断
③载体和目的基因的重组
④重组DNA的转化和扩增
⑤重组DNA的筛选和鉴定
整理课件
一、载体和目的基因的别离
为了进行基因重组，首先需要对载体
DNA和目的基因分别进行别离纯化，得
到其纯品。
〔一〕载体：
基因工程中常用的载体(vector)主要包括
质粒(plasmid)
噬菌体(phage)
病毒(virus)
这些载体均需经人工构建，除去致病基
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因，并赋予一些新的功能，如有利于进
存在于天然细菌体内的一种
独立于细菌染色体之外的双链环
状DNA，具有独立复制的能力，
通常带有细菌的抗药基因。
最早使用的质粒DNA是人工构建
的pBR322，该质粒分子大小为
4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青
霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，
HindⅢ等单一的限制酶切点。
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2．噬菌体：
可通过转染方式将其
DNA送入细菌体内进行增
殖。常用的为人工构建的
λ噬菌体载体。噬菌体两
端的片段对于其包装是必
需的，因而应予保存；而
其中间局部那么可进行改
造或置换，使之具有某种
单一的限制酶切点。目的
基因与噬菌体DNA进行重
组时，可采用插入重组方
式，也可采用置换重组方
式。
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3．病毒：
常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳
动物细胞中进行增殖。
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〔二〕目的基因：
目的基因的筛选和别离可采用以下方法进行：
1．直接从染色体DNA中别离：
仅适用于原核生物基因的别离，较少采用。
2．人工合成：
根据多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表
推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编
码小分子多肽的基因。
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3.从mRNA合成cDNA：
采用一定的方法钓取
特定基因的mRNA，
再通过逆转录酶催化
合成其互补DNA〔
cDNA〕，除去RNA
链后，再用DNA聚合
酶合成其互补DNA链，
从而得到双链DNA。
这一方法通常可得到
可表达的完整基因。
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4．从基因文库中筛选：
将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体
DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组
DNA的种群，称为G-文库(genomicDNAlibrary)。
将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然
后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C
-文库(cDNAlibrary)。C-文库具有组织细胞特异性。
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