产柠檬酸黑曲霉的筛选.pdfVIP

产柠檬酸黑曲霉的筛选

组长：高鸿飞

组员：刘光明，何笑军，董慧，王志昆，胡明慧

（西南大学药学院，重庆400716）

【摘要】：以从西南大学各处土壤中分离得到的黑曲霉作为出发菌株，并对其进行了初步分离。利用酸分离法和变

色圈法进行初步筛选，以产酸能力的强弱作为复筛指标，筛选到了一株稳定，高产柠檬酸的优势菌株。并利用正交实验法

优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培养基，紫外诱变育种法探究高产菌诱变的较佳时间。

【关键词】：黑曲霉；酸分离法；变色圈法；筛选；正交试验；诱变

柠檬酸又名枸橼酸，是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一。产柠檬酸的微生物包括真菌、细菌和酵母，黑曲霉

是迄今为止产柠檬酸最佳的微生物之一。本次实验的目的是从土壤中筛选柠檬酸的黑曲霉高产菌株，并对其培养基的配置

及最佳产酸条件进行探索，为今后进一步完善和优化其筛选工艺提供一定理论依据。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1出发菌种

从西南大学食堂周围，山顶，试验田土壤中分离获得。

1.1.2培养基

察氏培养基

成分硝酸钠3g

磷酸氢二钾1g

硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g

氯化钾0.5g

硫酸亚铁0.01g

蔗糖30g

琼脂20g

蒸馏水1000mL

制法：加热溶解，分装后121℃灭菌20min。

1.1.3其他柠檬酸，可溶性淀，Deniges试剂，蔗糖NH4NO3，KH2PO4，MgSO4·7H2O，溴甲酚绿指示剂，氢氧化钠溶

液，KMn04溶液

4

1.2实验方法

1.2.1黑曲霉筛选的流程

土壤→稀释分离→变色圈平板→挑菌→纯化→

摇瓶初筛→产物鉴定→复筛→正交实验→最优组合

→诱变育种

1.2.2黑曲霉的分离与鉴定

-2

采集表层以下5-10cm处土壤，称1.0g土壤迅速倒入装有玻璃珠的无菌水三角瓶中，配成10的土壤菌悬液，然

-3-4-5-3-4-5

后用移液管将其稀释到10、10、10倍。分别吸取10、10、10倍稀释液注入到酸分离培养基上以及涂布到察氏琼脂

培养基上，静置5min后倒置于恒温培养箱内35℃培养3-4d，观察菌落形态特征，挑选出黑曲霉疑似菌株。

1.2.3黑曲霉的初筛

将上述所得菌种连续划线接种到初筛培养基平板上，在37℃的恒温培养箱培养3-4d后，发现菌落周围有黄色的变色

圈（溴甲酚绿指示剂遇酸会产生颜色反应）。快速测定菌落及周围变色圈直径的大小，选择生长较快、变色圈与菌落直径

之比相对较大者作为初筛菌株。并利用Deniges试剂(HgO1g溶于20ml0.2L／LHS0中)鉴定柠檬酸和用0.1429mol/L的

24

NaOH测定产酸量

1.2.4黑曲霉的复筛

将初筛到的黑曲霉（变色圈明显）接种到摇瓶培养基中，发酵3-5d，重复培养一次。然后用0.1429mol/L的NaOH溶液

滴定10mL的发酵液，记录各自消耗NaOH的体积和计算产酸量。采用正交试验确定培养基浓度。选取四个主要影响因素：