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产柠檬酸黑曲霉的筛选
组长:高鸿飞
组员:刘光明,何笑军,董慧,王志昆,胡明慧
(西南大学药学院,重庆400716)
【摘要】:以从西南大学各处土壤中分离得到的黑曲霉作为出发菌株,并对其进行了初步分离。利用酸分离法和变
色圈法进行初步筛选,以产酸能力的强弱作为复筛指标,筛选到了一株稳定,高产柠檬酸的优势菌株。并利用正交实验法
优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培养基,紫外诱变育种法探究高产菌诱变的较佳时间。
【关键词】:黑曲霉;酸分离法;变色圈法;筛选;正交试验;诱变
柠檬酸又名枸橼酸,是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一。产柠檬酸的微生物包括真菌、细菌和酵母,黑曲霉
是迄今为止产柠檬酸最佳的微生物之一。本次实验的目的是从土壤中筛选柠檬酸的黑曲霉高产菌株,并对其培养基的配置
及最佳产酸条件进行探索,为今后进一步完善和优化其筛选工艺提供一定理论依据。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1出发菌种
从西南大学食堂周围,山顶,试验田土壤中分离获得。
1.1.2培养基
察氏培养基
成分硝酸钠3g
磷酸氢二钾1g
硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g
氯化钾0.5g
硫酸亚铁0.01g
蔗糖30g
琼脂20g
蒸馏水1000mL
制法:加热溶解,分装后121℃灭菌20min。
1.1.3其他柠檬酸,可溶性淀,Deniges试剂,蔗糖NH4NO3,KH2PO4,MgSO4·7H2O,溴甲酚绿指示剂,氢氧化钠溶
液,KMn04溶液
4
1.2实验方法
1.2.1黑曲霉筛选的流程
土壤→稀释分离→变色圈平板→挑菌→纯化→
摇瓶初筛→产物鉴定→复筛→正交实验→最优组合
→诱变育种
1.2.2黑曲霉的分离与鉴定
-2
采集表层以下5-10cm处土壤,称1.0g土壤迅速倒入装有玻璃珠的无菌水三角瓶中,配成10的土壤菌悬液,然
-3-4-5-3-4-5
后用移液管将其稀释到10、10、10倍。分别吸取10、10、10倍稀释液注入到酸分离培养基上以及涂布到察氏琼脂
培养基上,静置5min后倒置于恒温培养箱内35℃培养3-4d,观察菌落形态特征,挑选出黑曲霉疑似菌株。
1.2.3黑曲霉的初筛
将上述所得菌种连续划线接种到初筛培养基平板上,在37℃的恒温培养箱培养3-4d后,发现菌落周围有黄色的变色
圈(溴甲酚绿指示剂遇酸会产生颜色反应)。快速测定菌落及周围变色圈直径的大小,选择生长较快、变色圈与菌落直径
之比相对较大者作为初筛菌株。并利用Deniges试剂(HgO1g溶于20ml0.2L/LHS0中)鉴定柠檬酸和用0.1429mol/L的
24
NaOH测定产酸量
1.2.4黑曲霉的复筛
将初筛到的黑曲霉(变色圈明显)接种到摇瓶培养基中,发酵3-5d,重复培养一次。然后用0.1429mol/L的NaOH溶液
滴定10mL的发酵液,记录各自消耗NaOH的体积和计算产酸量。采用正交试验确定培养基浓度。选取四个主要影响因素:
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