细胞培养的基本步骤.pdfVIP

一．发展概况

组织培养(Tissueculture)是在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下。

使从体内取出的组织生存、生长繁殖和传代，并维持原有的结构和功能特性。广义的组织培

养与体外培养同义。体外培养(Invitro)包括所有结构层次的培养，即：组织培养、细胞培养

和器官培养。

所谓细胞培养(Cellculture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长。

组织培养的发展史已有近百年，最初的组织培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原

则上，用天然体液（如胎汁、血浆）来维持从整体切下的组织块，对细胞进行形态和功能的

观察。

通过许多学者大的改进和革新，培养基由天然动物血浆改为合成培养基，促进细胞生长物质

从胎汁改为动物血清。现在全世界贮存的细胞约有万种以上。组织培养不仅是细胞生物学必

需的技术，也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法。

二．基本原理和方法

体外培养细胞的生存条件：

(一)营养。

体外培养细胞所需的营养物质与体内相同，主要有糖、氨基酸和维生素三大类。目前市面上

销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够，但在使用合成培养基时，仍需加入

一些天然成份，如人或动物的血清、血浆和胎汁等。目前主要使用血清，以牛血清为主。血

清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。不仅

能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和

马血清次之。合成培养基中不加血清也能维持细胞生存，但不能很好生长，加入5%的血清，

对大多数细胞来说，能维持细胞不死和缓慢生长，要使细胞正常生长，一般需加10～15%

的小牛血清。每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每个批号

血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每5分钟摇一次。10%血清营养

液能促进细胞增殖称为生长液，2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维

持液。添加血清，虽利于细胞生长，但增加了不明成分，给分析实验结果带来了困难。因此，

人们正在探索不用血清的无血清液并已取得了一定进展。

（二）环境

1．无菌：无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细胞是高营养物，对细菌和

霉菌也是高度营养物，细胞培养中如污染微生物，其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡，

因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本

身、工作者本身。因此，培养室的空气等要彻底消毒，所有操作均要严格实行无菌操作，各

种物品拿入操作台前应消毒，用洒精擦表面，用前于紫外线照；操作者洗手、泡手，酒精擦

手，打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定，操作时须将瓶、管斜放，吸管注

入液体应避免和瓶口接触，操作时禁止讲话。

2.温度：组织培养的最适温度为35-37℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会

受到影响，甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度增加2-3℃对细胞产生

不良影响，使之在24小时死亡，温度在43℃以上，细胞大多被杀灭，而低温对细胞影响较

小，细胞置于25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度缓慢，放在4℃数小时之后，再置

37℃培养，细胞仍能继续生长。

3.气体：气体也是细胞生存的必需条件之一。所需的气体主要有O2和CO2。O2参与三羧酸

循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需

成分。它主要与维持培养液pH值有直接关系。

4.pH值：多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4，偏离此范围对细胞可产生有害的影响。各种细胞

对pH值的要求也不完全相同，但总的来说，细胞耐酸性比耐碱性大一些。培养液中的缓冲

体系主要是碳酸氢盐/CO2。细胞代谢产生的各种酸使pH下降，而培养液中的NaHCO3产生

CO2排入空间又使pH增加。

5.培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大，除少数悬浮生

长的细胞外，绝大多数细胞属于贴壁依赖性细胞或培养物。它们只有贴附于不起化学作用的

物体的表面时，才能生长、生存或维持功能。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。

玻璃器皿一般须用清洁液浸泡1至7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次，烤干备用。

用前160℃高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小时后，清

水洗净再用1NHCL浸泡4小时，用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗，37℃干燥后，紫外线灯照

射