细胞原代培养.ppt

细胞消化的最佳程度第63页,共81页，星期六，2024年，5月四、原代细胞的纯化和克隆体外培养的细胞绝大多数都呈混合生长，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步。第64页,共81页，星期六，2024年，5月1.细胞的纯化细胞的纯化分为自然纯化：长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的。如肿瘤突变细胞通过此方法建立细胞系。人工纯化：利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。主要有以下5种方法。Helacell第65页,共81页，星期六，2024年，5月（1）细胞因子依赖纯化法：通过加入某些特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子生长的细胞系。（2）酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的。另外对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。Epitheliumcellfibroblast第66页,共81页，星期六，2024年，5月（3）机械刮除法原代培养时,如果上皮细胞和成纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。可采用机械的方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域，第67页,共81页，星期六，2024年，5月（4）反复贴壁法成纤维细胞其贴壁过程快，能在短时间内完成附着过程，而上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。第68页,共81页，星期六，2024年，5月（5）电烙筛选法在贴壁细胞转化时，在培养瓶的细胞层中会出现分散的转化灶，细胞密集、排列规则，有明显生长趋势，与周边未能转化的细胞有明显的区域界限，可用烙筛选法烫死未转化细胞而保留转化灶细胞。第69页,共81页，星期六，2024年，5月2.细胞的克隆化细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株。第70页,共81页，星期六，2024年，5月主要的克隆方法有5种毛细管克隆法有限稀释克隆法平皿克隆分离法软琼脂克隆分离法单细胞显微克隆法第71页,共81页，星期六，2024年，5月（1）毛细管克隆法：将一定量的细胞悬液（如105/mL或更低）稀释至1个细胞/mL；取10mL稀释的细胞悬液，用直径为0.5mm，长为8mm的毛细玻璃管若干（30～50只），在负压作用下，使悬液吸入各毛细管中；在倒置显微镜下检查出每管只进入一个细胞的毛细管，然后放入适应性培养基或有饲养层细胞的培养瓶（或培养板）内；在CO2培养箱中培养，由一个细胞在毛细管繁殖后，并向管外扩展，并形成单个克隆的细胞群体。第72页,共81页，星期六，2024年，5月（2）有限稀释克隆法：取对数生长期的细胞制成悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上）。消化法制备低密度细胞悬液（1－2个/ml），0.5ml/孔接种于培养板，6－12h后观察标记含单个细胞的孔。待孔内细胞增至500-600个时进行分离培养。培养期间，视pH值的变化决定是否换液或补加培养液，一周左右，孔中有明显克隆出现。待克隆长至孔底面的1/3～1/2时，可用消化法将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养。第73页,共81页，星期六，2024年，5月第74页,共81页，星期六，2024年，5月有限稀释法计数103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔第75页,共81页，星期六，2024年，5月（3）平皿克隆分离法：将对数生长期细胞制备单个细胞悬液（悬浮细胞用吸管吹打分散，贴壁细胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培养基吹打分散）计数并用培养基调整细胞浓度，使5mL培养液内含有50～200个细胞（细胞存活率及单个细胞百分率应大于90%以上）。将上述细胞悬液迅速移入60mm平皿中，在37℃5%CO2下培养1周或更长。若有明显的克隆形成时方可进行克隆分离，方法有两种：第76页,共81页，星期六，2024年，5月①套环法：在倒置显微镜下观察克隆形成的情况，标记单个克隆周边，吸干培养基，用涂有少量无菌硅脂的无菌金属套环，套住标记的克隆，在套环内滴加少量0.25%胰蛋白酶，待细胞脱离时，用注射器针头轻轻吹打分散后，转入小平皿或