基因编辑荧光报告系统的建立.docx

PAGE15

基因编辑荧光报告系统的建立

摘要

随着基因编辑技术的发展，特别是近年来CRISPR/Cas9技术的出现，使基因编辑技术简便易行，从而为重大疾病的基因治疗和细胞治疗提供了一个新的技术突破点。但是基因编辑在基因组不同位点效率不同，为我们基因治疗造成一定困难。针对这个问题，我们拟设计一个基因编辑荧光报告系统，通过荧光表达效率来评价基因编辑效率。首先，我们构建了piggybac转座子为基础的PB-CAG-puro-T-sfGFP荧光报告载体，puro为筛选基因，T为基因编辑的Target序列，sfGFP是绿色荧光基因。Target位点和sfGFP基因之间是终止密码。然后，我们将报告载体转染到293T细胞中，利用嘌呤霉素我们筛选获得了染色体整合报告载体的293T细胞，并通过进一步测序证实这些细胞具有CAGpuro-T-sfGFP序列，由于target序列后有终止密码，绿色荧光基因无法表达，只有通过基因编辑实现密码子移码才会表达绿色荧光。最后，为了验证我们的基因编辑荧光报告系统的有效性，我们针对Target位点序列设计了CRISPR/Cas9基因编辑质粒，并转染到报告细胞中，观察到大量细胞表达了绿色荧光，表明基因编辑导致Target位点序列移码，实现了绿色荧光基因的表达。通过本课题研究，我们成果建立了一套有效的基因编辑荧光报告系统，实现了基因编辑的实时的直观的观测，为基因编辑研究以及制作基因重组细胞和动物提供了有用的工具。

关键词：CRISPR/Cas9技术,基因敲除,荧光报告系统,239T细胞

第1章文献综述

1.1基因编辑技术发展现状

基因编辑（Geneediting），也称基因组工程，近年来，通过开发诸如锌指核酶（ZFN）、转录激活器样效应器核糖核酸酶（TALEN）、巨型核素酶（MNs），以及与CRISPR相关蛋白质（CRISPR/Cas）组合的CRISPR等工具，让精确改变人类基因的能力成为可能。通过产生有针对性的删除，插入，基因敲出和点变异，或瞄准和修改

RNA，将转录因子或表观遗传机制定位到DNA来调节基因表达。内源修复机制用于对DNA进行必要的修饰。它们包括非同源端连接、同源定向修复、同源独立目标整合、微同源介导端连接、位点修复和不匹配修复。

基因编辑技术的临床开发正在多个领域取得进展，包括癌症治疗的免疫疗法、艾滋病毒感染的抗病毒治疗以及治疗遗传性疾病，如β-地中海贫血、刀状细胞疾病、溶酶体储存障碍和视网膜营养不良。其巨大的潜力将会继续做出贡献。

1.2基因编辑技术的方法

1.2.1同源重组

同源重组允许两种相同或几乎完全相同的序列组成DNA分子之间互相传递遗传信息，是修复双链DNA断裂的主要途径，也是进化的主要驱动力。同源重组的一个关键方面是重组蛋白质的能力，用以完全对齐受损的DNA与位于基因组其他地方的同源序列。这种反应被称为同源搜索，类似于许多不同的DNA结合蛋白进行的目标搜索。这种方法的缺点是效率太低，失误率高。

1.2.2核酸酶

基因组编辑取决于在基因组中产生特定的预先设计的改变的能力。引发双链断裂（DSBs）、单链断裂（也称为刻痕）或特定基数变化导致内源修复机制的激活，可用于改变基因组。用于基因编辑的四种核酸酶分别是巨核酸酶（Meganuclease）、锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）和聚集的规则间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）系统[1]。MNs、ZFN和TALENs是哺乳动物细胞中基因组编辑的第一批工具。MN是自然发生的内核，可以重新定位到新位点。与ZFN和TALENS的基因编辑结果来自FokI核酶域与锌指核酸酶DNA结合模块（在

ZFN的情况下），转录激活样效因子（TALEs）在TALENS的情况下融合。总的来说，这些基因编辑工具的设计和构造可以是结合起来应用的，它们执行基因编辑的效率也各不相同。

1)锌指核酸酶

作为可编程DNA的原型平台，锌指核糖核酸酶（ZFN）在基因组工编辑的研发运用中作主要支撑。ZFN有锌指蛋白（ZFPs）和FokI限制酶两个可分离DNA结合域和非特定域的两部分结构。研究发现ZFN可以诱导DSB，与细胞同源重组有关联。ZFN首先确立了对包括人类细胞在内的哺乳动物细胞的定制位置进行有针对性的修改是可能的，从而引发了基因组工程。

2)转录激活样效因子核酸酶

转录激活器般的效应体核酶（TALENs）是面对不同细胞类型和生物体进行定向基因组编辑的有力工具。它包括一个TaleDNA结合区域和一个FokI限制内核糖核酸区域。与Tale蛋白结合的DNA由TALA重复单元的基因阵列指定一个DNA碱基对进行中介，每个单元由3