干涉BmSuc1后家蚕丝腺Serpin18基因的转录表达水平分析.docx

干涉BmSuc1后家蚕丝腺Serpin18基因的转录表达水平分析

摘要：家蚕Serpin18基因（BmSerpin18）编码丝氨酸蛋白酶抑制剂，能够抑制丝素酶，仅在五龄的中部丝腺高量表达,育蛹期消失，能够调节丝素酶对丝素蛋白的降解过程。而BmSuc1基因与蚕的糖酵解途径以及抗逆性有关。前人研究的基因表达谱分析结果表明，BmSuc1与BmSerpin18在家蚕五龄幼虫时期有明显的特异性表达，提示两个基因有表达互扰的可能。本课题在RNA干扰BmSuc1的表达后，利用荧光定量和半定量PCR研究BmSerpin18在丝腺各部分的表达丰度，进一步分析两者之间的关系。最后发现在中部丝腺的前中后以及后部丝腺组织中，RNAi-BmSuc1蚕体中

BmSerpin18的表达水平较Nistari蚕体显著下调，尤其是在中部丝腺的前部。

关键词：桑蚕；BmSuc1;Serpin18；荧光定量PCR

1.前言

Bombyxmori作为一种经济生物和重要的模式生物，也是少数以桑叶为食的鳞翅目泌丝类昆虫，报告表明其原因是可以利用桑叶中的蔗糖成分作为营养物质。而BmSuc1是调节家蚕中肠内蔗糖水解程度的关键基因，对于桑蚕的发育具有重要的作用，沉默该基因幼虫会发生营养不良或者体型异常的现象，该基因被证实是编码β-FFase的基因

[1]，在蔗糖水解活性的条件适应酶系统中起着重要角色。Serpin18作为一类丝氨酸蛋白抑制剂基因家族中的一员，其实起着抑制作为半胖氨酸蛋白酶的丝素酶的功能，而丝素酶分解的丝素蛋白是蚕产出的经济商品的主要成分，在蚕丝中约占七八成。两个基因在五龄家蚕的前中部丝腺中有着特异性表达的现象，探究这样的“巧合”有助于揭示丝腺发育的调控。

家蚕分泌蚕丝依靠其特别分化的器官—丝腺，其特殊的生理构造与生物功能使其在人类的角度成为最重要的器官。根据其构造可以分为四个部分，位于家蚕头部的吐丝口，以及消化管两侧的三个主要部分，分别命名为前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺。根据功能，大致上与膜细胞器的分工类似，分泌丝素蛋白的后部丝腺，转运到中部丝腺后被丝胶蛋白包裹加工，再经由前部丝腺来到吐丝口，从而完成丝蛋白的合成、转运和分泌。这样精巧的分工引得大量科研人员的研究，为此如果能通过提高丝素蛋白的分泌量，则会获得巨大的经济收益。从形态学到基因组学，前者研究丝腺的时空特异区段的功能联系与互相作用，其中发现不同功能的基因群体，大致集中表现为H+离子通道、表皮蛋白表达、糖代谢以及丝氨酸蛋白酶抑制剂等功能[2]。丝素蛋白成熟分泌需要经过变构等加工，而前部丝腺中发生的丝素蛋白构想改变需要ATP供能，此时与糖代谢有关的蛋白参与此过程，提供必要的能量，同时为了避免蛋白降解，丝氨酸蛋白酶抑制剂便参与该过程保护蛋白。如此精密的系统安装在幼小的家蚕内部（如图1）。

图1.家蚕丝腺结构示意图（引自与纺织网）

Fig1.Schematicdiagramofsilkglandstructureinsilkworm

它们各自相隔，却又如单个细胞内的膜系统似的功能紧密，蛋白的合成、加工、运输一气呵成。丝素酶对于丝素蛋白含量的调控，与丝腺的发育有着密切的周期关系。家蚕的2-4龄，丝素酶的表达量维持稳定且较低，只是参与一些必要的蛋白降解，以免吐丝异常；后期含量升高主要是有利于丝腺的更新与发育；五龄期间含量迅速降低，保证了丝腺的快速生长与吐丝量的增高[3]。而此期间通过基因组分析，Serpin18的表达量在此期间也有所增加。

Serpin类蛋白属于丝氨酸蛋白酶抑制剂三大类中的一类，其特点是具有较高的同源性以及较大的分子量，是以自杀式的方式作用靶蛋白，位于C端的活性中心环与靶酶蛋白结合形成酶-抑制剂复合物，两者都发生构想改变，类似底物结合位点的RSL环（20个左右氨基酸）是其发挥作用的重要前提[4]。Serpin18继承了该类蛋白保守的结构区域核心β-折叠片区域和α–螺旋区域，识别靶蛋白酶的Val362，实验表明它只抑制半胖氨酸蛋白酶类，而对于丝氨酸蛋白酶类没有明显的抑制作用。当Serpin18作用时，是先与靶蛋白酶形成一个瞬时中间态，该中间态会致使蛋白酶的自身降解，从而达到抑制的作用[5]。丝素酶（Fibroinase）是一种半胖氨酸蛋白酶，Serpin18是它的抑制剂，以至于在五龄期即使有丝素酶的存在，丝素蛋白仍然大量存在。五龄前中期特异性基因Serpin18是保证这一时期丝腺有效储存丝蛋白以及后续发育分泌的关键，而该时期特异表达的Serpin18是否与同时期特异表达的基因存在关联是研究的关注点。同时期特异性表达的BmSuc1是与糖代谢相关的基因，或许环境的改变，糖代谢途中产生的信号分子刺激基因表达水平的变化。干涉BmSuc1后是否会影响Serpin1