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真核表达载体pPDGF-NEP的构建及表达

一、真核表达载体pPDGF-NEP的构建

（一）、材料

各种Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、所有DNAmarker及凝胶回收试剂盒、

质粒提取试剂盒均购自大连Takara公司；全血基因组DNA提取试剂盒购自上海生工生物工

程技术服务有限公司。

质粒pSIMPLE-19EcoRⅤ/BAP载体购自大连Takara公司；真核表达质粒pEGFP-1、质

粒pcDNA3.1(+)、质粒pCSC-SPPW-net由山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所保

存。

（二）、方法

2.1.PDGF启动子的获取

用全血基因组DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，根据Genbank上的PDGF

基因全序列（Genbank：HSN10C3,2782bp,该序列中含有一个EcoRⅠ酶切位点）设计多对

引物，并在上下游外引物F/R上分别加入Bsp106及KpnⅠ酶切位点。第一步先以基因组DNA

为模板，分别使用内引物F/R、F/R进行分段PCR扩增，获得PCR产物1和PCR产物2。

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第二步以PCR产物1和PCR产物2为模板，以外引物F/R进行PCR扩增，扩增产物即为

2782bp的PDGF启动子序列。第三步将上一步获得的PCR产物通过酶切插入至pSIMPLE-19

EcoRⅤ/BAP载体中构建pSIMPLE-19-PDGF，并进行酶切、测序鉴定和扩增（实验步骤见

图1）。各引物序列：

F0：5’-CTTACGGGCTGTGTGACCTT-3’；

F：5’-ATCGATAGCATGGAGAGGCTACAGGTAGAGT-3’；

F1：5’-TCTCTGCCACTGTGCCACGCT-3’；

R：5’-GGTACCGGCAGTCGATGGTTCGTCTTCACTC-3’；

R1：5’-AGCGTGGCACAGTGGCAGAGA-3’。

图1神经特异性启动子PDGFpromoter的调取

2.2.NEP基因的获取

根据NCBIGenbank提供NEP、β-actin的基因序列，β-actin：

F5’-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3’，

R5’-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’；

引物NEP：F5’-AAAGCTAAAAAGAAAACAG-3’，R5’-CAGTGCCAACAAACAAAT-3’，扩

增片段大小分别为395、575bp，引物为上海博亚公司合成。

从质粒pCSC-SPPW-net上用ApaⅠ切出含NEP片段，同时将质粒PEGFP-1用ApaⅠ酶

切，线性化，用碱性磷酸酶处理防止载体自身环化，然后电泳回收NEP片段和线性化的质

粒PEGFP-1，用T4DNA连接酶过夜连接，转化，挑单克隆在培养液中培养，提质粒，酶切

测序鉴定正反向，用BamHＩ、KpnⅠ切下NEP片段，得到两端带有KpnⅠ、BamHＩ酶切

位点的NEP片段。同时用BamHＩ、NotⅠ双酶切质粒pcDNA3.1(+)，胶回收小片段适配子

和带有KpnⅠ、BamHＩ酶切位点的NEP片段，用T4DNA连接酶过夜连接，最后得到两端

带有KpnⅠ，NotⅠ酶切位点的目的基因片段。取一小部分整片段电泳鉴定以及酶切鉴定正

确后，待用。

2.3.pPDGF-EGFP的构建

使用Bsp106和KpnⅠ双酶切质粒pSIMPLE-19-PDGF获得PDGF启动子片段，用Hind

Ⅲ和KpnⅠ双酶切质粒P-EGFP-1获得载体大片段。将上述获得的两个片段与两端含有Hind

Ⅲ和Bsp106末端的适配子进行3片段连接，构建真核表达载体pPDGF-EGFP。适配子序列：

F：5’-AG