19 基因工程应用——以RRSV-S10基因的克隆表达为例.ppt

转化1、连接产物5ul加入感受态细胞中；2、混匀，冰上30min-------cell吸附DNA3、42℃,90s－－－－热击，促进DNA进入cell4、冰上1～2min－－使细胞复原5、加1mlLB(无Amp)－－外源DNA还未表达6、37℃培养1h－－Amp抗性基因表达7、6000rpm*30s，浓缩100ul8、涂板（Amp板）－－抗性筛选9、37℃培养过夜。克隆的Amp抗性筛选PCR筛选EcoR1和Xho1双酶切筛选表达筛选９.7万6.6万４.3万３.1万CBD2.6万P103.2万P10-CBD5.8万测序验证P10（３.2万）蛋白的纯化９.7万6.6万４.3万３.1万P10水稻齿叶矮缩病毒(riceraggedstuntvirus,RRSV)*终止密码子呢？*Intein:DTT诱导自剪切CBD：chitinbindingdomain（几丁质结合位点）MCS:多克隆位点Amp：Amp抗性基因内含肽intein是位于宿主蛋白质中的一段插入序列，前缀in一取自inventing,后缀tein一取自protein。与内含肽相对应的另一专用术语是外显肽。内含肽基因不是一个独立的基因，必须插入于外显肽基因才能复制转录，可从前体蛋白中切除并将两侧外显肽连接起来成为成熟蛋白质。其对应的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白对应的核酸序列之中，与宿主蛋白基因存在于同一开放阅读框架(openreadingframe，ORF)内，并与宿主蛋白质基因进行同步转录和翻译，当翻译形成蛋白质前体后，内含肽从宿主蛋白质中切除，从而形成成熟的具有活性的蛋白。intein指蛋白质的内含子。同mRNA一样，一些前体蛋白质具有内含子(intein)序列，位于多肽序列的中间，经加工切除后，两端的蛋白质外显子(extein)连接为成熟蛋白质分子，典型的intein在N-末端通常有150个氨基酸序列在C-末端有约50个氨基酸序列。*牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在westernblot中作为Blockingagent；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。*5种通用缓冲液+1种基本缓冲液，各酶的基本缓冲液组成不同，相互之间不能通用。***Elute洗脱Dialyze透析、渗析*RRSV-S10基因的克隆表达实验设计1.酶切位点的选择2.载体的酶切方案3.引物的设计4.RT-PCR程序的设计5.基因的酶切方案6.克隆的筛选方案7.蛋白功能研究方案1.酶切位点的选择(1)RRSV-S10基因的下载(2)RRSV-S10-ORF的获取(3)表达质粒pTXB1MCS的分析(4)RRSV-S10-ORF酶谱的分析基因下载(2)RRSV-S10-ORF的获取(3)表达质粒pTXB1MCS的分析限制性内切酶缓冲溶液反应温度Nhe1M37oCNot1H+BSA+TritonX-10037oCEcoR1H37oCXho1H37oCSap1NEBbuffer425oC同尾酶的分析非同尾酶2.载体的酶切方案当EcoR1切开载体时,Xho1无法切动;当Xho1切开载体时,EcoR1可切开载体.(1)EcoR1切开AATTCCTCGAG--------GGAGCTC--------(2)Xho1切开-------GAATTCC-------CTTAAGGAGCT所以，载体酶切方案为：Hbuf,37oC,Xho1酶切2hours以上；再加EcoR1酶切过夜3.引物设计P+:(EcoR1)5’GGAATTCATGCCTTTCGTGCAATTC3’P+引物验证P-(XhoI):

5’CCGCTCGAGCTCTGCGTCATCACCAAAG3’P-引物分析和验证引物合成P+(EcoR1):5’GGAATTCATGCCTTTCGTGCA