L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌及其构建方法与应用 .pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN102102086A

(43)申请公布日2011.06.22

(21)申请号CN201010235511.3

(22)申请日2010.07.22

(71)申请人天津大学

地址300072天津市南开区卫津路92号天津大学

(72)发明人闻建平李爽贾晓强

(74)专利代理机构天津市北洋有限责任专利代理事务所

代理人王丽

(51)Int.CI

C12N1/20

C12N15/09

C12P7/56

C12R1/15

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌及

其构建方法与应用

(57)摘要

本发明涉及L-乳酸脱氢酶基因缺失

的工程菌及其构建方法与应用。利用PCR

扩增L-乳酸脱氢酶基因(ldh)上下游序列

ldh1、ldh2，并将克隆片段连接到基因敲除

载体上，将构建好的敲除载体导入到谷氨

酸棒杆菌中，利用同源重组的方法将菌株

中的L-乳酸脱氢酶基因(ldh)沉默后筛选获

得基因工程菌C.glutamicumRes167Δldh。

本发明利用同源重组的方法使谷氨酸棒杆

菌中L-乳酸脱氢酶基因沉默，从而得到产

纯D-乳酸的基因工程菌。用本发明的工程

菌进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量量达

到20g/L以上，纯度为99％以上。本发明

将在D-乳酸的工业化生产中发挥重要作

用，具有广阔的应用前景。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

未缴年费专利权终止IPC(主分

类):C12N1/20专利

2022-07-08号:ZL2010102355113申请专利权的终止

日权公告

日

权利要求说明书

1.L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌，其特征在于所述基因工程菌为谷氨酸棒杆菌

Res167Δldh(CorynebacteriumglutamicumRes167Δldh)，保藏于中国微生物菌种保藏

管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.3973。

2.L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌的构建方法，其特征是基因工程菌是利用PCR

扩增L-乳酸脱氢酶基因(ldh)上下游序列ldh1、ldh2，并将克隆片段连接到基因敲除

载体上，将构建好的敲除载体导入到谷氨酸棒杆菌中，利用同源重组的方法将菌株

中的L-乳酸脱氢酶基因(ldh)沉默后筛选获得基因工程菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤如下：

(1)根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组ldh编码基因的上下游DNA序列，设计

PCR引物；

(2)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，扩增ldh基因上下游片段

ldh1和ldh2，利用重叠PCR进行拼接，构建基因敲除同源片段ldh1-ldh2；

(3)建立连入ldh1-ldh2的ldh编码基因的基因敲除载体pK18mobsacB-ldh；

(4)电转化制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞；

(5)利用卡那抗性的正向筛选和10％蔗糖培养基的反向筛选，筛选出阳性菌株，

PCR验证得到L-乳酸脱氢酶基因缺失的工程菌C.glutamicumRes167Δldh。

4.根据权利要求3所述的方法制备方法，其特征在于所述的PCR的引物序列为：

uldh1：5′-CCAAGGTGCCGACACTAAT-3′

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