一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法 .pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN104327171A

(43)申请公布日2015.02.04

(21)申请号CN201410521738.2

(22)申请日2014.09.30

(71)申请人成都欧林生物科技股份有限公司

地址610000四川省成都市高新区天欣路99号

(72)发明人陈道远马礼耕罗力心陈克平李靖

(74)专利代理机构成都金英专利代理事务所(普通合伙)

代理人袁英

(51)Int.CI

C07K14/33

C07K1/36

C07K1/34

C07K1/18

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

一种层析纯化法生产破伤风类毒素

原液的方法

(57)摘要

本发明公开了一种层析纯化法生产

破伤风类毒素原液的方法，属于生物技术

领域，生产方法包括：将破伤风杆菌培养

液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤

浓缩至原体积的1/20～1/10，洗涤浓缩液

并收集；浓缩液经离子交换层析、疏水层

析、一次膜过滤、脱毒、超滤和二次膜过

滤得破伤风类毒素原液。本发明提供的一

种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方

法具有工艺简单、操作方便、生产效率

高、成本低的优点，经本发明方法生产的

破伤风类毒素成分更加单一、纯度更高，

从而获得更好的免疫原性，降低接种副反

应的发生。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1.前处理：将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原

体积的1/20～1/10，洗涤浓缩液并收集；

S2.离子交换层析：将上述浓缩液上样于平衡好的Q-SepharoseFastFlow层析柱，

用15～25mmol/LPB、0.16mol/LNaCl溶液洗脱，收集洗脱峰即为IEX毒素目标蛋

白；

S3.疏水层析：向步骤S2中收集的洗脱液中加入等量15～25mmol/LPB、1.5～

2.5mmol/L硫酸铵，并上样于平衡好的PhenylFF层析柱，使用PB缓冲液洗脱，收

集洗脱峰即为HIC毒素目标蛋白；

S4.一次膜过滤：用PBS缓冲液稀释HIC毒素目标蛋白至600～800Lf/ml，加入终

浓度为20mmol/L的L-赖氨酸盐酸盐，调pH为7.0～7.4，再加入终浓度为0.25%

的甲醛溶液，滤膜过滤除菌；

S5.脱毒：将一次除菌过滤后的毒素分别在2～8℃的温度下放置1d、室温下2d、

35～40℃的温度下21天进行脱毒，即为脱毒液；

S6.超滤：脱毒液经30KD的超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/15，洗涤浓缩

液并收集；

S7.二次膜过滤：将步骤S6的超滤液经滤膜过滤除菌，滤液即为破伤风类毒素原

液。

2.如权利要求1所述的一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，其特征在于，

步骤S1、S6中所述洗涤浓缩液的方法为：用15～25mmol/LPB缓冲液反复清洗浓

缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液。

3.如权利要求1所述的一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，其特征在于，

步骤S4中采用氢氧化钠溶液调pH为7.0～7.4。

4.如权利要求1所述的一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，其特征在于，

所述脱毒过程中每5～7天取样测定pH值，并使用氢氧化钠溶液调整脱毒液的pH

值为7.0～7.4。

5.如权利要求1所述的一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，其特征在于，

步骤S4、S7中所述滤膜的孔径为0.2μm。

说