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1、掌握蛋白质在双水相系统中分配系数的测定方法。
2、了解蛋白质与考马斯亮蓝的显色反应原理及应用。
3、进一步巩固可见分光光度计的操作及制作标准曲线。
4、双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。利用生物物质在
两相中不同的分配，可以实现它们的分离；生物大分子在双水相中上相和下相的
K=C/CPH
浓度比被定义为分配系数（tb）；分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、、
无机盐种类等因素影响。
5、考马斯亮蓝与蛋白质可结合形成蓝色复合物，在595nm有最大光吸收，并且在低浓度时，
吸光值与蛋白质浓度服从朗伯比尔定律。
牛血清蛋白溶液、考马斯亮蓝染色液（G-250）、蒸馏水、相体积比实验中分离得到的
上下相、可见分光光度计、恒温水浴锅、移液管、试管及试管架等
1
（）制作标准曲线：
6牛血清蛋白溶液（120卩g/ml）0.000.20
①取支试管，用移液管分别准确加入体积为、、
0.400.600.801.00ml1.00ml
、、、，然后均用蒸馏水稀释至。
②再分别加入5.00ml考马斯亮蓝染色液，混匀。
C±C
③于251的恒温水浴锅中保温10min（为防止试管歪倒或混淆，可把水浴锅盖子打开，
将试管同试管架一起水浴）。
④冷却后，于595nm进行吸光值测定，以装有1.0ml蒸馏水的试管为对照。
gOD
⑤然后，以以试管中中蛋白质总量（卩）为横坐标，以相应的吸光值（595nm）为纵坐标
作图，得标准曲线。（注意所得6点至少应有3点在同一直线上，否则标准曲线不可用，应
参照其他组线性较好的标准曲线进行计算）
2
（）样品测定：（若颜色太深，一般要重新取样品再做）
Xml1.00ml1
上相溶液：用移液管吸取上相液，蒸馏水定容至，按（）法测定吸光值。
Yml1.00ml1
下相溶液：用移液管慢慢插入离心管底部，吸取下相液，蒸馏水定容至，按（）法测定吸光
ml13
值。（以上样品取的，往往要根据具体情况来调整。参考值：、只刻度离
0.1ml0.4ml240.3ml0.3ml
心管，上相取,下相取,、只刻度离心管，上相取,下相取）
2~67844
可按下表操作（为标准曲线，和代表实验三的四支离心管的个上相和个
下相）：
管号34
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