脑神经系统-神经解剖学研究方法课件.ppt

脑神经系统-神经解剖学研究方法神经解剖学的研究方法脑神经系统-神经解剖学研究方法一、传统的研究方法（一）大体研究方法：显示脑血管、主要核团和纤维束、脑室等。塑化标本用于断面解剖学。（二）组织学研究方法：固定、切片、染色1.H.E染色2.硝酸盐镀染：机制不清(显示神经元轮廓和突起的行向)。3.Nissl法：碱性染料---核酸结合(焦油紫、甲苯胺蓝、培花青等)。脑神经系统-神经解剖学研究方法二、近代的研究方法（一）组织化学的研究方法：生化学+组织学：固定良好，称量准确，器皿洁净，严格操作。1.酶组化：底物(有色)原位沉淀四氮唑盐或金属(铅、钴、铜)(1)胆碱能神经元的检测：乙酰硫胆碱硫胆碱铁氰化物亚铁氰化物(2)NO能神经元的检测：β还原辅酶A蓝色沉淀硝基四氮唑蓝酶AchECu棕色沉淀++(黄递酶)NOS脑神经系统-神经解剖学研究方法（二）荧光组化(FluorescenceHistochemistry)自发荧光和诱发荧光：紫外光标本激发滤片物镜吸收滤片目镜1.单胺荧光组化：(1)甲醛诱发荧光：(2)乙醛酸诱发荧光：CA四氢异喹啉双氢异喹啉5HT四氢β-咔啉二氢β-咔啉FAorGA蛋白催化H+(绿色荧光)FAorGA蛋白催化H+(黄色荧光)脑神经系统-神经解剖学研究方法(三)免疫组化(Immunohistochemistry)1.原理：抗原抗体反应。重链N端可变区抗体活性部分Fab段轻链C端稳定区抗原决定簇Fc段C端FcFabN端重链轻链C区V区C区抗原第一抗体F标记物直接法抗原第一抗体间接法第二抗体F标记物脑神经系统-神经解剖学研究方法2.PAP法的原理注意事项：1)一抗的特异性要强，效价要高。2)二抗的量要足(双桥PAP法)。3)PAP复合体与一抗来自同一动物种属。4)要设对照试验(吸收试验、置换试验、交叉试验)。5)提高染色质量的措施：H2O2甲醇液—去内源性HRP；TritonX-100—增加通透性；酶消化，微波—重新释放抗原。脑神经系统-神经解剖学研究方法(四)免疫荧光组化基本原理：显示标记物改酶标为荧光素(异硫氰酸荧光素FITC、四甲基异硫氰酸罗达明TRITC)，在荧光显微镜下观察。AB直接(A)和间接(B)免疫荧光法原理示意图脑神经系统-神经解剖学研究方法(五)亲合免疫组织化学1.原理：是利用两种物质之间的高度亲和力与免疫反应结合起来的技术。这些物质包括：植物凝集素与糖类，生物素与亲合素，葡萄球菌A蛋白与IgG，阳离子与阴离子，激素与受体。2.ABC法的原理(AvidinBiotin-peroeidaseComplex)亲合素—生物素过氧化物酶复合体3.ABC法的优点：(1)灵敏度高；(2)非特异性着色较少；(3)使用和操作较简便。脑神经系统-神经解剖学研究方法4.SABC法的原理(StreptAvidinBiotin-enzymeComplex):链酶亲合素—生物素—酶复合物亲合素链酶亲合素分