细菌性食物中毒的快速检验.pptVIP

污染原因PCR扩增产物污染——最主要最常见的污染问题标本间交叉污染——主要由于盛装标本的容器被污染、加样枪污染导致标本间污染、有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶扩散，导致彼此间的污染防止污染的方法**STEP4STEP3STEP2STEP1合理分隔实验室分装PCR试剂防加样枪引起污染选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管时动作要轻，以防管内液体溅出。原则上分为四个分隔开的工作区域：壹贰试剂贮存和准备区；叁标本制备区；肆扩增反应混合物配制和扩增区；伍扩增产物分析区。经典PCR巢式PCR多重PCR膜结合PCR原位PCR对称引物系统PCR将反应系统中由于引物浓度的巨大差别，导致扩增的产物以某条单链DNA为主的PCR称为不对称PCR。两条引物的浓度相差很大（50～100：1），浓度低的称为限制性引物，浓度高的称为非限制性引物，在最初的十几个循环中，两条DNA的目的片段得到等量扩增，但后来限制性引物被消耗殆尽，只有非限制性引物尚存，扩增的产物主要为该引物引导的单链DNA。不对称PCR主要为序列测定制备单链DNA以RNA为模板的PCR称为逆转录PCR（ReverseTranscriptasePCR,RT-PCR），与前述PCR的不同之处在于首先需在一单引物的介导和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链，该互补链称为cDNA，通过加热使逆转录酶失活后，加入另一引物，再以该cDNA为模板，在DNA聚合酶催化下合成目的双链DNA片段。逆转录PCR的模板可为细胞、病毒的总RNA或细胞mRNA，该方法常用于检测RNA病毒或研究真核细胞的基因表达是利用荧光素、同位素或生物素等对PCR引物的5’端进行标记，通过检测荧光素或者同位素，直接显示产物的存在；或者利用生物素—亲合素系统与酶促反应结合，借助酶促反应的放大效应，显示目的片段的存在，更加提高PCR的灵敏度。不同荧光素标记不同引物---彩色PCRPCR-ELISA法---个引物的5’端，使其携带便于PCR产物固定于微孔板的的功能基团，如生物素；而另一引物或者探针的5’端修饰便于用酶连免疫吸附试验检测的基团如FITC，经此修饰后的引物仍能引导PCR的特异扩增反应，扩增后的产物不需电泳，直接加入链霉亲合素包被的聚丙乙烯微孔板，通过生物素与链霉亲合素反应，使产物以及生物素修饰的游离引物固定于微孔板，但只有产物可与随后加入的HRP-抗FITC抗体结合，借助检测酶活性反映PCR产物的多少是将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合起来，以检测微量蛋白质的方法。如：将与被检物对应的单克隆抗体先吸附在固相载体上，然后使被检抗原与之反应，再用生物素化的特异性多抗结合此抗原，通过亲合素再与生物素化DNA相连结，再以适当的引物对DNA指示分子进行扩增，以扩增产物的有无与多少，反应待测抗原的存在与数量**细菌性食物中毒的快速检验平山县疾控中心食源性疾病世界卫生组织将食源性疾病定义为“凡是通过摄食而进入人体的病原体，使人体患感染性或中毒性疾病，统称为食源性疾病”食物中毒食物中毒是指人摄人了含有生物性、化学性有毒有害物质后或把有毒有害物质当作食物摄入后所出现的而非传染性的急性或亚急性疾病，属于食源性疾病的范畴。食物中毒既不包括因暴饮暴食而引起的急性胃肠炎、食源性肠道传染病(如伤寒)和寄生虫病(如囊虫病)，也不包括因一次大量或者长期少量摄入某些有毒有害物质而引起的以慢性毒性为主要特征(如致畸、致癌、致突变)的疾病。食物中毒诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行的。食物中毒诊断标准及技术处理总则GB14938-1994**中毒特征名称常见食物潜伏期病程主要症状重点采集标本沙门氏菌肉蛋类4-48h3-7d恶心呕吐腹痛腹泻发热38-40℃便食品血副溶血弧菌水产品3-24h1-3d呕吐发热腹痛以上腹部为主水样便腹泻便食品变形杆菌肉蛋及水产品5-18h1-3d恶心呕吐腹痛腹泻发热38℃左右食品便致泻性大肠凉拌菜4-44h1-3d呕吐腹痛腹泻水样便或粘液便发热39℃便食品蜡样芽孢杆菌米饭、肉、乳呕吐型0.5-5h腹泻型8-16h1d恶心呕吐为主腹痛腹泻为主食品呕吐物葡萄球菌肉、乳、蛋2-4h1-2d恶心频繁剧烈呕吐腹痛腹泻食品呕吐物粪链球菌肉、乳、蛋、冷冻食品5-10h1-2d恶心呕吐腹痛腹泻食品呕吐物粪便肉毒梭菌