DB21T 2536-2015 副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法.pdfVIP

DB21T 2536-2015 副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法.pdf

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ICS65.020.30

B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2536—2015

副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法

Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofMycobacterium

aviumsubsp.paratuberculosis

2015-10-15发布2015-12-15实施

辽宁省质量技术监督局发布

DB21/T2536—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位:辽宁出入境检验检疫局。

本标准主要起草人:吴斌、万超、屈菲。

I

DB21/T2536—2015

副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了副结核分枝杆菌(Mycobacteriumaviumsubssp.paratuberculosis)实时荧光PCR

检测方法。

本标准适用于副结核分枝杆菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct值:达到阈值的循环数(CycleThreshold)

DEPC:焦碳酸乙二酯(Diethylpyrocarbonate)

Taq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)

RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)

实时荧光PCR:荧光逆转录聚合酶链反应(RealTimeFluorescentQuantitativeReverse

TranscriptionPolymeraseChainReaction)

4原理

采用TaqMan方法,比对副结核分枝杆菌基因组5端非编码区最保守的核苷酸序列,设计特异性引物

和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示),3端标记

TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表示),它在近距离内能吸收5端荧光基因发出的荧光信号。PCR反

应进入退火阶段时,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所

吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶的5到3的外切核酸酶功能将探针降

解。这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循

环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。

5试剂和材料

1

DB21/T2536—2015

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水;所有试剂均用无RNA

酶的容器分装。

5.1

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