非小细胞肺癌基因检测.ppt

标本因素对EGFR突变检测的影响--肿瘤组织特点--遗传异质性对检测方法敏感度有较高要求正常细胞混杂标本因素对EGFR突变检测的影响--组织标本种类--对检测方法有相应要求，组织标本及DNA质控尤其重要冰冻新鲜组织固定包埋组织--外科手术标本 完整，量多 广泛--小活检标本 完整，量少 受限--外科手术标本 片段化，量多 受限--小活检标本 片段化，量少 极度受限DNA质与量 适用方法图4.EGFR基因检测使用的临床样本及其操作。A.被切成10微米的石蜡包埋标本。B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存，C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于AL缓冲液，此状态可以室温保存。肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本病理学评估组织切片非小细胞性肺癌诊断及类型肿瘤细胞比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞HE染色片用于病理评估白片用于提取DNA建议最少切片数： --手术标本，5μmX4 --小活检标本，5μmX8组织标本来源手术标本支气管下活检经皮穿刺活检标本处理及贮存新鲜冻存：液氮或-80CFFPE目前EGFR基因突变的检测方法很多DNA直接测序法应用广泛，可检测已知的突变和未知的突变，但对标本的肿瘤细胞含量要求较高，一般要求标本中肿瘤细胞的比例在50%以上，至少不低于30%。基于实时荧光定量PCR基础上的方法（如ARMS法）较直接测序法更加敏感，可检测样品中1.0%~0.1%的突变基因，更适合用于肿瘤细胞含量较少的小标本检测。ARMS方法操作简单，是目前临床上较常用的方法之一，但只能检测已知的突变，且标本需进行预处理，检测费用较高。检测方法直接测序法流程及数据分析PCR**纯化测序反应测序仪毛细管电泳纯化数据分析EGFRdeletionEGFRL858R电泳质控组织标本DNA**PCR是关键：--特异性--产物长度--必要时巢式--建议通用测序引物ARMS法操作流程及数据解读DNAARMS反应实时定量PCR数据分析内参信号(HEX)突变信号:+ -内参信号:+ +标本＃1（突变阳性）标本＃2（突变阴性）突变信号(FAM)组织标本内参信号(HEX)测序法与ARMS法比较测序法ARMS敏感度20-30%1%FFPE标本成功率低高检测流程复杂慢长简单快速数据分析要求高低假阳性机会(交叉污染)多少假阴性机会多少仪器成本高低商用试剂盒无有试剂成本低略高小结：了解你的标本 --新鲜/冰冻组织FFPE组织 --手术标本小活检标本选择合适的方法 --ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展 --测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及做好组织标本及DNA质控是关键非肿瘤组织标本的有效利用 --在无肿瘤组织情况下，外周血cfDNA、胸水及细针穿刺等细胞学标本均可用于检测EGFR突变，但其确切的敏感度与特异性尚需进一步探索 --必须选择足够敏感的方法-*-ANNUALBUSINESSREVIEW*EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。19外显子上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见.21外显子上的L858R的点突变占所有突变的45%左右18外显子的3种点突变（G719X）约占5%；20外显子上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关,占1%左右。*EGFR-KTI的有效性也因突变种类的不同而不同。外显子19缺失突变的有效率为81%，与此相对L858R的有效率为71%，G719X的有效率为56%。值得特别注意的是7例外显子20的插入突,变病例中没有EGFR-KTI有效病例**现介绍下送检标本的一般注意事项*非小细胞肺癌基因检测

肿瘤二科刘丽珠随着分子医学进展