DB43T 1670-2019 非洲猪瘟病毒检测 免核酸提取荧光PCR法.docxVIP

ICS65.020.30B41

DB43

湖南省地方标准

DB43/T1670—2019

非洲猪瘟病毒检测

免核酸提取荧光PCR法

DetectionofAfricanSwineFeverVirus

Real-timePCRwithoutDNAExtractionMethod

2019-10-15发布2019-12-15实施

湖南省市场监督管理局发布

I

DB43/T1670—2019

目次

前言 Ⅱ

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4主要仪器设备 1

5主要耗材 1

6试剂 2

7样品处理 2

8样品检测 3

9结果判定 3

10生物安全要求 3

附录A（规范性附录）试剂的配制 4

II

DB43/T1670—2019

前言

本标准按GB/T1.1—2009给出的规则起草。

请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省畜牧水产局提出，由湖南省农业农村厅归口。

本标准起草单位：湖南省动物疫病预防控制中心、湖南国测生物科技有限公司。

本标准主要起草人：何世成、王昌建、刘道新、喻正军、石建、范叶、林源、唐小明、黄建龙。

1

DB43/T1670—2019

非洲猪瘟病毒检测免核酸提取荧光PCR法

1范围

本标准规定了免核酸提取检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR方法。本标准适用于我省范围内开展非洲猪瘟病毒核酸快速检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

非洲猪瘟（AfricanSwinefever，ASF）

由非洲猪瘟病毒（AfricanSwinefevervirus，ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，其发病率和病死率均可达到100%，是世界动物卫生组织（OIE）的法定报告传染病，在我国属于一类动物疫病。

3.2

荧光PCR

实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymerasechainreaction）。

4主要仪器设备

荧光PCR仪；台式离心机（转速≥12000r/m）；小型离心机（转速≥6000r/m）；-20℃冰箱；微量移液器[（0.2～2.5）μL、（1～10）μL、（10～100）μL、（20～200）μL、（100～1000）μL等规格]；组织匀浆仪；高压灭菌锅；分析天平（精度0.01g）；生物安全柜。

5主要耗材

无DNase/RNase1.5mL离心管；与荧光PCR仪匹配的PCR薄壁管或8联排管；与移液器配套的各规格吸头。

DB43/T1670—2019

2

6试剂

6.1引物与探针

引物和探针的设计基于ASFVvp72基因序列，序列如下：

a)上游引物：5’-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3’，使用浓度为20μmol/L。

b)下游引物：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’，使用浓度为20μmol/L。

c)探针：5’-FAM-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，使用浓度为10μmol/L。

6.2核酸释放剂

核酸释放剂配制方法见附录A.1。

6.3荧光PCR试剂

6.3.1TaqDNA聚合酶，浓度为5U/μL。

6.3.2尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶），浓度为2U/μL。

6.3.3dNTPs：由等量dATP、dUTP、dGTP、dCTP组成，终浓度为25mmol/L。

6.3.42×PCR缓冲液：配制方法见附录A.2。

6.4阴性与阳性对照

6.4.1阳性对照：灭活的非洲猪瘟病毒阳性样品，Ct值≤30，-20℃保存备用。

6.4.2阴性对照：非洲猪瘟病毒核酸阴性样品，-20℃保存备用。

7样品处理

7.1样品类型

猪脾脏、淋巴结等组织样品，血清、抗凝血，拭子样品。样品的采集、