大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.pptVIP

*******实验九，十

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，称感受态细胞。感受态细胞121.概念一.实验原理转化转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。01受体细胞经过一些特殊方法(如物理制备法,化学制备法等)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。02进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。03将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。04转化转化过程RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但制备较复杂，不适合实验室用电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击仪CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃以下保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛.010203KCl法，CaCl2法，电击感受态制备等常用的感受态细胞制备方法CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现，其基本原理是：细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。CaCl2法制备感受态细胞原理细胞生长状态和密度质粒的质量和浓度试剂的质量防止杂菌和杂DNA的污染提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。质粒的质量和浓度:A用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。B提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处试剂的质量:整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。防止杂菌和杂DNA的污染：材料，设备及试剂E.coliDH5α菌株；质粒、1）材料1恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪，eppendorf管等。2）设备31.5ml离心管（又称eppendorf管）卡那霉素；21mol/L的CaCl2LB液体培养基LB固体培养基Kana母液：卡那霉素(Kanamycin)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备用试剂12三.操作步骤本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可通过卡那霉素抗性