DB43T 1957-2020 稻曲病菌分子检测技术规程.docxVIP

ICS65.020CCSB16

DB43

湖南省地方标准

DB43/T1957—2020

稻曲病菌分子检测技术规程

TechnicalRegulationsforMolecularDetectionofUstilaginoideavirens

2020-12-29发布2021-03-29实施

湖南省市场监督管理局发布

DB43/T1957—2020

I

目次

前言 Ⅲ

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4原理 1

5仪器设备与试剂 1

5.1仪器设备 1

5.2主要试剂 1

6采样 2

6.1样品采集 2

6.2样品贮运与存放 2

7操作方法 2

7.1样品DNA制备 2

7.2检测 2

8结果判定 3

9样品保存与处理 3

附录A（资料性）稻曲病相关资料 4

附录B（规范性）水稻稻曲病菌鉴定报告 5

DB43/T1957—2020

III

前言

本文件按照GB/T1.1—2020给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本文件由湖南省农业农村厅提出。

本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：湖南省植物保护研究所、株洲市农业科学研究所。

本文件主要起草人：陈岳、谭新球、李成刚、吴龙云、王淋玉、张卓、张鑫、史晓斌、李小娟、肖友伦、张德咏、刘勇。

DB43/T1957—2020

1

稻曲病菌分子检测技术规程

1范围

本文件规定了稻曲病菌PCR检测的样品制备、检测技术和操作程序。本文件适用于土壤、水稻种子和稻谷中稻曲病菌的分子检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

稻曲病菌无性态为Ustilaginoideavirens，属半知菌亚门、腔孢纲、瘤座孢目、绿核菌属，病原有性阶段有性态为Clavicepsoryzaesativae，属子囊菌门、子囊菌纲、麦角菌属、稻麦角菌。稻曲病主要危害水稻穗部并形成稻曲球，严重影响水稻的产量和稻米品质。见附录A。

PCR（PolymeraseChainReaction），聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

4原理

核糖体基因转录间隔区（InternaltranscribedspacerITS）进化速率较编码区快，在真菌种间存在着丰富的变异，而在种内不同菌株间却高度保守，可以为病原菌的分子检测提供理想的靶序列。根据稻曲病菌ITS的特异序列，合成1对特异性引物，获得稻曲病菌特异性扩增片段，用于土壤、水稻种子和稻谷中稻曲病菌的快速分子检测。

5仪器设备与试剂

5.1仪器设备

PCR检测仪、凝胶成像仪、土壤取样器、台式离心机、纯水仪、电泳仪、旋涡振荡器等。

5.2主要试剂

DB43/T1957—2020

2

苯酚/氯仿/异戊醇、乙醇、二甲基亚砜、氢氧化钠、脱脂奶粉、DNAmarker、吐温20、PCR试剂盒等。

除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的规定。

6采样

6.1样品采集

6.1.1土壤

水稻田W型5点取样，取1-10cm深度的50g土壤样品。6.1.2水稻种子和稻谷

将稻种或稻谷混匀后称取50g。

6.2样品贮运及存放

样品采集后，放入密闭的容器内，送实验室。将取样结果进行记录，记录表格见附录B。处理的样品应保存在-20℃以下，避免反复冻融。

7操作方法

7.1样品DNA制备

7.1.1土壤中DNA的提取

土壤风干后，制成100目的土壤样品，取10g土壤加入5mL无菌水，冷冻抽干24-48h，加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将