感受态和提取质粒精美生物医学.pptVIP

感受态细胞的制备

及质粒DNA的提取为什么要制备感受态细胞？01什么叫感受态？02为什么能用碱裂解法提取到质粒？03提取中用到哪些溶液，有什么用处，可以打乱使用顺序吗？04制备感受态细胞的必要性如需将结合了外源DNA的质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。0102感受态细胞(Competentcells):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RbCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的状态，成为感受态。2.感受态细胞的概念Ca2+处理细胞的原理1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时呈现感受态挑单个菌落接种到20mlLB培养基中，37℃剧烈振荡过夜。取1ml过夜培养物,接种到25mlLB培养基中,37℃振荡培养1-2小时，直至培养夜中细菌浓度达到OD600为0.2-0.4(细菌对数期生长)。或取1ml甘油菌，接种到100mlLB培养基中，37℃振荡培养1-2小时。(共接两瓶)培养物冰上放置10min，4000rpm,4℃离心10分钟，收集菌体。4、感受态细胞的制备步骤01将菌体悬浮于5ml预冷的CaCl2中,冰上放置20分钟。024000rpm,4℃,离心10分钟，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在2mlCaCl2中，0-4℃保存24至48小时。03或缓慢滴入甘油(灭菌)至浓度为15％,轻柔混匀，将细菌分装成0.2ml/每管，干冰上放置1小时，转入-80℃冰箱储存。制备感受态细胞的注意事项细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．一定时间内使用经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降01（这是由于总活菌数随时间延长而减少造成的）02．所使用的器皿必须干净。痕量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率30I高速冷冻离心机用途细菌、蛋白沉淀；核酸提取；细胞/亚细胞组份分离。动、植物病毒分离、血液血清提取及溶液中大、小颗粒不同组份的分离。、操作步骤101打开离心机盖,选择容量适合的转子，将带样品离心管放入转子内（样品一定要平衡好）。022关好离心机盖，设定离心机转子型号、转速、离心时间、温度、启动运转。3离心时间到待转速降至零，打开离心机盖将样品（离心管）取出，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线。1开机前应检查转头按装是否牢固，机腔有无异物掉入。2样品应预先平衡。3离心机运行时，离心机周围30cm范围内不能有人和危险物品。4挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。5注意事项易燃易爆以及易与其他物质发生反应的物质不能离心。01在没有相应的防护措施时，不能离心有毒的、放射性的物质或病原微生物。02离心机运行时不可人为地打开盖子。03如果转头和盖子有可见的腐蚀或磨损的痕迹，则应立即停止使用。04使用的玻璃或塑料离心管应能承受相应的离心力并大小合适。非金属转头不可用紫外照射。05如果被离心的物品密度大于说明书的规定范围，应根据RCF计算公式，减小离心体积。06注意事项转头应定期清洗和消毒。擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。01使用消毒液处理时，温度不可超过25℃，时间不可超过规定时间。02可以用高压消毒的转头，应在清洗后，121℃消毒20分钟，转头务必平放，并不受挤压，以免变形。03每次操作完毕；应作好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。04离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。05维护和保养二、提取质粒提纯的思路：01要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA03质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA022、原理碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们在碱性时，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。实验器具微量取液器(20