分子杂交精美生物医学.ppt

标记物稳定灵敏，检测方便安全04高特异性（~500bp）03单链核酸（ssDNA）02标记物（32p,35S,125I,地高辛（DIG）,FITC）01探针基本条件（特点）（1）、标记物

放射性同位素标记物

非放射同位素标记物探针标记物放射性标记物：32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)非放射性标记物：半抗原：生物素、地高辛荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）01a、放射性标记物02特点：03可用放射自显影技术检测，信号的强弱易于进行定量分析。04主要缺点05射线对人体有伤害06放射性物质需特殊的处理07半衰期短不宜存放使用B、非放射性标记物

常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素。

特点：

敏感性不如同位素标记

稳定性和分辨率高

检测时间短

操作简便

不需特殊的防护设备

不存在放射性污染（六）核酸的固定烘烤80℃2小时01紫外光固定02碱固定03预杂交目的：减少非特异性杂交【探针会与其他非互补核酸产生非特异性结合，所以杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭】成分：去污剂：1%SDS（可促进溶液对薄膜的覆盖，可抑制RNase酶活性）高分子化合物：Denhard氏溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。鲑鱼精子DNA（与探针无同源性）封闭剂：2、杂交影响杂交的因素碱基组成：探针的Tm高，杂交速率快核酸分子浓度与杂交速率高浓度双链探针的杂交01020403盐浓度：离子强度与杂交速率成正比；与杂交稳定性也成正比。温度：与杂交速率成正比。甲醛：可降低Tm值。错配的核酸序列：错配降低杂交速率。杂交的加速剂（八）洗膜除去溶液01未反应的探针02与滤膜疏松结合的探针03非特异性结合的探针04（九）杂交信号的检测放射自显影01非放射性杂化分子的检测02血迹中的DNASouthernblot应用DNA指纹分析SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。Northern印迹杂交

应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。

分子杂交技术与应用

为什么叫印迹法呢？04Southern印迹法有哪些步骤，为了达到什么目的呢03分子杂交的基本方法有哪些？02分子杂交技术的目的是什么？01酸碱热变性剂（尿素）有机溶剂（乙醇）????????????????????????????????????????????????????????????????????????变性后核酸的特点：粘度下降密度增加紫外吸收增加定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最融解温度（Tm）：大值一半时的温度。杂交01定义

两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即分子杂交。DNA/DNA的杂交作用：检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA：揭示核酸片断中某种特定基因的位置。02011975，Southern印迹杂交法:DNA021977，Northern印迹杂交法：RNA031979，Western印迹杂交法：Protein1由Southern1975年设计。被检测对象为DNA。2Southern印迹杂交具体研究什么呢？克隆基因DNA的酶切图谱分析【哪里可以剪开】基因组中某一基因的定性与定量分析【有没有这个基因；在哪里】基因点突变【在哪个地方出现突变】限制性片段长度【可以被剪开的片段多长】010302带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程（一）待测核酸样品的制备提取待测DNA用限制酶将DNA切成大小不同的片段用EDTA，65℃灭活限制酶，进入下一步骤——