基因诊断-肿瘤的分子诊断.pptVIP

点突变：导致特异性限制性内切酶位点改变1直接诊断：检测已知致病基因2血红蛋白病可以由血红蛋白结构或合成异常所致的遗传性疾病。前者称为异常血红蛋白病，后者称为地中海贫血。针对异常血红蛋白病如镰刀状红细胞贫血症是由于?珠蛋白基因的第6位密码子GAG突变成GTG，导致蛋白结构异常。对此遗传病的基因诊断可采用PCR-限制性内切酶分析技术。1镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变：2×5′3′正常基因5′3′突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析PCR-RE分析MstIICCTGAGG-CCTGTGG+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析21点突变：（2）无限制性酶切位点改变PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交等技术。PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。直接诊断：检测已知致病基因3Β地中海性贫血基因诊断（PCR-ASO）已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，32P标记，进行SouthernBlot杂交/斑点杂交。NormalβΑGeneProbe——与正常βΑ杂交MutationβSGeneProbe——与异常βS杂交01βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS03突变探针02正常探针1、Gene缺失遗传病的诊断1）α地贫的Gene诊断α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个αGene时可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobeαα/αααα/α-αα/--α-/----/--正常缺1缺2缺3缺414kb10kb010302以αGene为探针，Southernblot方法检测直接诊断：检测已知致病基因基因重排\缺失：核酸分子探针杂交与PCR在DNA序列上有较长一段序列的重新排布。包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等Southern印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座直接诊断：检测已知致病基因杜氏肌营养不良症的基因诊断1DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79个Exon，cDNA全长13974bp，编码3685Aa，分子量427kD。DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%~70%。2DNAMarker2.阳性对照3.孕妇1.DNAMarker2.阳性对照3.孕妇胎儿5.阴性对照4.胎儿5.阴性对照采用多重PCR法扩增该基因的多个外显子基因表达异常01mRNA的相对定量分析02mRNA长度分析03直接诊断：检测已知致病基因当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和遗传标记的连锁分析间接地作出诊断。01连锁分析基于遗传标记与Gene在染色体上连锁，通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判断并做出诊断。02遗传标记（限制性片段长度多态性、微卫星DNA序列、单核苷酸多态性等）03二、遗传病间接诊断1Southernblot--RFLP诊断(PKU)PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。间接基因诊断患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正