7-3第七章食品微生物检验-大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌计数.ppt

6.大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠杆菌的卫生学意义1)大肠菌群和大肠艾希氏菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。第一，它可作为粪便污染食品的指示菌，第二，它可以作为肠道致病菌污染食品的指示菌。当食品中检出的大肠菌群数量多，肠道致病菌存在的可能性就愈大。2)大肠菌群中包含的菌种可以在人、畜粪便中检出，而其检测方法简单，计数容易，菌群中包括的菌种类多，检出几率高，但有少数菌种可在营养丰富的水体、土壤、腐败的植物等外环境中检出，即在非粪便污染的情况下，也有检出符合大肠菌群定义细菌的可能性，故在结果分析时应当慎重。而耐热大肠菌群的菌绝大多数均为埃希菌属的成员，更能表示样品被粪便污染的情况。（二）大肠菌群计数1.大肠菌群计数方法类型A.MPN计数法（最可能数法）(GB4789.3—2010，GB/T5750.12—2006)最常用的，适合于各类样品。B.平板计数法(GB4789.3—2010)大肠菌群数量较多的样品可使用C.滤膜法(GB／T5750.12～2006)主要用于生活饮用水、瓶装水和其他清亮液态样品。D.测试片法(纸片法)(GBl4934—94)常用于餐具大肠菌群检测。2.食品微生物学检验大肠菌群计数

（GB4789.3—2010）第一法：大肠菌群MPN计数法第二法：大肠菌群平板计数法3.MPN法原理当欲对样品中某种细菌进行选择性计数时，由于样品中混有其他细菌，无法采用平板菌落计数的方法进行计数，在这种情况下可用MPN法计数菌数，特别是对菌数少的样品进行选择性计数很有用处，因为倾注平板法和表面涂布法计数的加样量分别为lml和0.1ml。最常用的MPN法是多管发酵法对水和食品中的大肠菌群的计数。该法还可用于计数粪大肠菌群、产气荚膜梭菌等。最可能数(mostprobablenumber，MPN)法是基于泊松分布的一种间接计数方法，又称为多管发酵法，是采用多次稀释直至无菌(multipledilutiontoextinction)的方式进行。首先将被检样品尽量混合或研磨，使其中的细菌分布均匀，混合的样品通过系列稀释和等量分配为小样品，有些小样品最后含菌量极少，或不再含有待测的目的细菌；分别接种不同的小样于相应的培养管，培养后观察有无目的菌生长，查用概率计算方法制成的MPN检索表，推算原始样品中待测细菌的可能数。大肠菌群MPN法是利用大肠菌群细菌能分解乳糖产酸产气的特性进行检测即对未知样品做连续的10倍稀释，选择3个连续的10倍稀释液，每种稀释液接种3管装有培养基的试管中培养，根据LST初发酵试验以及BGLB发酵证实实验，证实大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的最可能数。食品中大肠菌群数以每g（mL）样品中大肠菌群的最可能数来表示，即为大肠菌群MPN值。6.操作步骤1）样品的稀释（1）固体和半固体样品-称取25g样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液。（2）液体样品以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10的样品匀液。（3）样品匀液的pH值应在6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。（5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。5）填写原始记录8）注意事项（1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slowlactosefermentations）”来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。（2）初