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番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程

1范围

本文件规定了番茄细菌性斑点病抗性的相关术语和定义、接种体制备、病原菌鉴定、鉴定条件和试验设计、接种、病情调查、抗病性评价的操作指示。

本文件适用于番茄细菌性斑点病抗病性苗期室内鉴定和评价。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T1858.1番茄主要病害抗病性鉴定技术规程第1部分：番茄抗晚疫病鉴定技术规程

3术语和定义

NY/T1858.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

番茄细菌性斑点病

由丁香假单胞杆菌番琉致病变种（Pseudomonassyringaepv.tomato）引起。叶片是主要的受危害部位，叶片边缘发病明显。初期斑点细小，呈圆形或近圆形，中间深褐色，周围有黄色晕圈，随后病斑慢慢扩大、增多，发病中后期，病斑变成黑色、深褐色，病斑直径2mm～4mm，多个病斑可相互连接形成不规则的较大病斑。

4试剂与材料

4.1试剂

所用试剂在未加说明时均采用分析纯试剂。实验室用水应符合GB/T6682中规定的三级水要求。

4.2NA液体培养基

称取牛肉浸膏3g，蛋白胨8g，蔗糖或葡萄糖10g，酵母浸膏1g，加蒸储水至1000mL，加热煮沸，调节pH至7.0，分装，高压灭菌(121℃,25min)。

4.3NA固体培养基

称取牛肉浸膏3g，蛋白胨8g，蔗糖或葡萄糖10g，酵母浸膏1g，加蒸储水至1000mL，先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其余各成分用少量水化开加入，煮沸，调节pH至7.0，分装，高压灭菌(121℃,25min)。

5接种体制备

5.1病原菌分离

5.1.1采样时选取发病典型、新发病的番茄叶片，用封口袋保存，做好采集地点、时间的记录，及时带回实验室，用常规组织分离法分离病原菌。

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5.1.2将工具放置在超净工作台上，打开紫外灯灭菌40min。用剪刀剪取病健交界处组织并制片，在显微镜下进行观察是否具有喷菌现象。将出现喷菌现象的组织在无菌条件下进行分离。用75％的乙醇溶液消毒30s后用无菌水冲洗1次，再用0.1％HgCl消毒20s后用无菌水冲洗3次。将清洗后的组织剪碎，加入3ml无菌水，静置10min。接种环在酒精灯上烧红后晾冷，沾取菌液，在NA固体培养基上划线。于28℃恒温培养箱下培养。

5.2病原菌纯化

分离培养2d后，用消毒接种环挑选单菌落在NA固体培养基上进行划线。重复进行纯化操作，直至菌落形态一致，无杂菌。

5.3接种体保存

将纯化菌落移至1ml灭菌离心管中，放置在-25℃冰箱中保存。

6病原菌鉴定

6.1致病性鉴定

6.1.1接种悬浮液制备

将保存的病原菌转移到NA液体培养基中，温度28℃,转速120r/min，震荡培养48h。在波长λ=600的条件下测定OD值，将菌液稀释至OD值0.6～0.8，菌液浓度为1×108cfu/ml。

6.1.2烟草过敏反应

用注射器吸取菌液，沿着叶脉注射到烟草叶片叶肉组织中，24h后观察是否出现斑枯过敏反应。

6.1.3接种

用注射器吸取菌液，沿着叶脉注射到健康番茄植株叶片组织中，接种后，置于温度25℃,空气湿度90％～100％的人工气候箱中培养。

6.1.4结果判定

烟草发生斑枯过敏反应和接种健康番茄植株后，叶片出现斑点，斑点有黄色晕圈等典型症状可初步判定病原菌为番茄细菌性斑点病致病菌。

6.2病原菌16srDNA分子鉴定

6.2.1DNA制备

保存的接种体活化后，用接种环挑取1环新鲜的菌落放入装有0.5ml灭菌水的离心管中，置于震荡器充分震荡混匀。放入100℃水中加热5min后，快速转入冰水混合物中放置10min。在转速4000r/min，离心10min后，取上清液。

6.2.2PCR扩增

以病原细菌的总基因组DNA为模板，上游引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），下游引物1942R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行扩增。

6.2.3结果判定

将PCR扩增产物进行测序，测序结果在GenBank中进行序列比对。

7鉴定条件和实验设计

7.1鉴定室

苗期抗病性鉴定的鉴定室能够人工调节室内温度、湿度和光照，使之具备良好的发病环境。

7.2鉴定设计