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粮油检验粮食中游离氨基酸含量的测定方法

1范围

本文件规定了分光光度法测定粮食中游离α-氨基酸含量的原理、试剂和材料、仪器和设备、样品制备、样品测定、结果计算和精密度。

本方法适用于小麦、糙米、大米、玉米等粮食中游离α-氨基酸含量的检测。本方法的检出限（LOD）为4mg/kg（以氨基氮计）。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB5009.3食品安全国家标准食品中水分的测定

GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27404实验室控制规范食品理化检测

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

用无氨蒸馏水提取粮食及其加工品中的游离α-氨基酸。在一定高温条件下，反应液中加入的水合茚三酮，与游离α-氨基酸中的氨基反应，产生双-1,3-二酮茚蓝紫色化合物，其颜色的深浅与游离α-氨基酸的含量成正比。采用可见分光光度计，在波长570nm下，测定反应产物的吸光值，计算粮食中游离氨基酸的含量。

5试剂和材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682中一级水的规定。

5.1无氨蒸馏水。

5.2异丙醇。

5.3水合茚三酮，C9H4O3·H2O。5.495%乙醇。

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5.5硼氢化钠，NaBH4。

5.6乙酸钠，CHCOONa·3H2O，分子量136.08。

5.7冰乙酸。

5.8L-亮氨酸，分子量131.12，纯度≥98.5%。

5.910%异丙醇水溶液：量取10mL异丙醇（5.2）溶于无氨蒸馏水（5.1），并定容至100mL。

5.10抗坏血酸。

5.113%茚三酮试剂：称取3.0g水合茚三酮（5.3），用95%乙醇（5.4）溶解，移入100mL容量瓶，定容至刻度，贮于棕色瓶中，保存在4℃冰箱。茚三酮试剂保存时间如要超过1个月，可加入0.02%NaBH4（5.5）。

5.12乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）：称取360.0g乙酸钠（5.6），溶于约300mL无氨蒸馏水（5.1）中，加入66.67mL冰乙酸（5.7）后，用无氨蒸馏水（5.1）定容至1L，置于超声波清洗机，超声10min，除去气泡。

5.13标准氨基酸溶液（1μmol/mL或14μg氨基态氮）：精确称取在80℃下烘干的亮氨酸（5.8）13.1mg，溶于10%异丙醇水溶液（5.9）中，移入100mL容量瓶中，用10%异丙醇水溶液定容至刻度，摇匀，置于冰箱中保存。

5.140.1%抗坏血酸：称取50mg抗坏血酸（5.10），溶于50mL无氨蒸馏水（5.1）中，随用随配。

5.15己烷。

5.16石英砂。

6仪器和设备

6.1天平：感量10mg、0.1mg。

6.2粉碎机：可使试样粉碎后全部通过20目标准筛。

6.3检验砻谷机。

6.4漩涡振荡器。

6.5震荡摇床。

6.6离心机:最高转速不低于6000r/min。

6.7超声波清洗机。

6.8电热恒温水浴锅:85℃±1℃。

6.9可见分光光度计:波长570nm；玻璃比色皿，10mm。

6.10电热恒温鼓风干燥箱。

7样品制备

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7.1扦样与分样

按GB/T5491执行。

7.2样品处理

谷物、大豆及其加工产品于粉碎机中研磨成粉，称取1.0g谷物粉样或0.5g大豆粉样于50mL离心管中，加入15mL己烷（5.15），涡旋30s，置于震荡摇床中3h脱脂，4000r/min下离心10min，弃去己烷层，下层沉淀于通风橱中挥发至干。将脱脂样品倒入研钵，用5.0mL无氨蒸馏水（5.1）分两次洗涤离心管并转入研钵中，加入少量石英砂（5.16）在室温下充分研磨，再用5.0mL无氨蒸馏水（5.1）分两次洗涤研钵并转入离心管中。4000r/min下离心10min，上清液即为游离α-氨基酸提取液。含油量高的大豆样品离心后的上清液含有悬浮物，可用定量滤纸进行过滤。

8样品测定

8.1标准曲线的制作

取10mL玻璃刻度试管，按照表1加入各种试剂，涡旋30s，置于85℃水浴锅中反应12min，在冷水中快速冷却，立即加入5mL95%乙醇，涡旋30s。此时溶液呈现蓝紫