体外转录与翻译.pptVIP

基因工程基因体外转录与翻译四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统（4）对mRNA要求用原核和真核细胞的mRNA转录本有明显的区别。通常真核mRNA带有转录后加工的5-7methyl-GTPcap和3poly(A)tail，有助于增加mRNA的稳定性，防止降解。同时5帽子结构有助于核糖体与mRNA的结合和AUG起始密码的正确识别。对应不同的体外表达系统，我们在设计RNA模版的时候就要区别对待。原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码。这段位于AUG上游的序列和30S核糖体亚基的16srRNA一段序列互补，保守区5-UAAGGAGGUGA-3，核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响，在设计的时候要注意。真核生物的那段保守序列成为Kozak序列（5-GCCACCAUGG-3），要高效翻译，+1G和-3A就很重要。不过如果mRNA没有这段Kozak序列而有一段适当长度5UTR也能够有效地在无细胞体系中得到翻译。*主讲人:杜珍武E-吉林大学药学院基因工程教研室GeneticEngineering基因工程基因体外转录与翻译invitrotranscription/translation基因体外转录与翻译一、基因体外转录与翻译的意义二、基因体外转录原理与操作三、基因体外转录应用四、基因体外翻译的原理与操作五、基因体外翻译的应用基因工程基因体外转录与翻译基因体外转录与翻译的意义基因工程基因体外转录与翻译一、基因体外转录与翻译的意义费事、费力、工序烦琐？？？体外操作体内操作研究蛋白质、RNA方便需要快速、方便获得蛋白质、RNA基因工程基因体外转录与翻译需要的基本物质：DNA模板启动子、结构基因转录终止子RNA聚合酶四种核糖核酸转录因子二、基因体外转录原理与操作基因体内转录的过程基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作1、基因体内转录的过程真核基因转录原核基因转录基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作2、基因体外转录的原理基本的工作原理是以DNA为模板，在转录体系中的一系列转录因子的作用下，经RNA聚合酶合成RNA。基因体外转录体系在1976年由PELHAM和JACKSON建立。体外转录体系逐渐成熟。基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（1）RNA聚合酶（RNAPolymerases）常用的聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶T7、SP6、T3特异识别模板启动子转录效率比大肠杆菌的聚合酶效率高酶的来源及质量高基因工程基因体外转录与翻译1基因体外转录原理与操作2基因体外转录的操作RNA聚合酶（RNAPolymerases）3基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（2）线形的DNA模板（linearDNAtemplate）要求：有RNA聚合酶识别的双链启动子，被转录基因。质粒（Plasmids）基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（2）线形的DNA模板（linearDNAtemplate）PCR产物（PCRProducts）

基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（2）线形的DNA模板（linearDNAtemplate）寡核苷酸（Oligonucleotides）

CDNA基因工程基因体外转录与翻译010203基因体外转录原理与操作基因体外转录的操作基本反应体系基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（４）基本反应分型普通型（ConventionalSynthesis）在一个反应体系内得到的ＲＮＡ量较少，主要由于ＲＮＡ探针制备大规模型（LargeScaleSynthesis）在一个