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临床精液染色技术及形态分析

精子正常形态

涂片的制作与染色

每份新鲜的精液标本应制备2张以上的涂片。???

每次取样前要充分混匀精液。

对于未稀释的精液，采用拉薄技术；对于已洗涤的精液，采用移液管法。

要用铅笔做记号，记号笔会脱色。

染色时2张涂片背靠背，使染色时间一致。用水冲洗已染色的涂片的力度和时间也要尽量一致。

未经稀释的精液的涂片方法；（b）洗涤后的精子悬液的涂片方法。

在精液液滴之前“拉”，而不要在液滴之后“推”

精液涂片的厚度，影响因素有：

液体的体积(10μl)…………体积越小，则精子分散越好

拉片的角度(45°)…………角度越大，则涂片越薄

涂片的速度(~1秒)…………速度越高，则片子越厚

空气干燥的精液涂片，如果固定会出现的缺点：

脱水——比湿片小

剪切力——不成熟的精子头膨胀

渗透损伤——胞浆小滴的丢失，过多的残余胞浆滞留推荐采用Papanicolaou、Shorr或Diff-Quik染色法。

使用光学显微镜观察，精子头部顶体区为浅蓝色、顶体后区为深蓝色，中段略呈红色，尾部为蓝色或红色。残余的胞浆小滴染成粉红色或橙红色。

染色方法选择

若采用人工分析精子形态，建议用巴氏染色法，涂片可以永久保存，符合质控要求。

Diff-Quik染色法适合CASA，只有3个步骤，用时不足一分钟，但涂片不能保存。所以CASA必须能够保存每条精子的形态图片，而且要有图像回放功能才符合质控要求。

Shorr染色法与巴氏染色的效果近似，步骤较少，涂片可以长期保存，适合人工分析。

改良巴氏染色

有20个步骤，耗时40-60分钟。脱色时间长短影响染色强度。染色背景较浅。

Diff-Quik染色

有4个步骤，耗时1-2分钟。仅精子表面着色，对细胞膜影响小。

背景较深。

精子形态

正常精子形态

精子头部长度为4.0-5.0um

宽度为2.5-3.5um

长宽之比为1.50-1.75

顶体界限清晰，占头部的40%-70%

中段稍细，宽度1um,约为头部长度的1.5倍

尾部直，均一，比中段细，非卷曲，长度约为45um

形态异常精子

1、畸形精子：头部畸形、中段偏厚、双尾

2、畸形精子：头部畸形、中段畸形

3、畸形精子：梨形头、中段弯曲、不规则、胞浆小滴过多

4、畸形精子：头部畸形

5、畸形精子：梨形头

6、畸形精子：头部畸形

?形态异常精子

19、畸形精子：头部畸形、空泡数2

20、畸形精子：头部正常、顶体70%

21、畸形精子：头部畸形、顶体70%

22、畸形精子：头部畸形、顶体40%

23、畸形精子：头部畸形、顶体40%

对于头部异常的描述

对于颈和中段异常的描述

对于主段异常的描述

非精子细胞

未评估精子

精子多重缺陷的指标

畸形精子指数（theteratozoospermiaindex，TZI)=缺陷总数/缺陷精子数。

精子畸形指数（thespermdeformityindex，SDI)=缺陷总数/精子总数。

TZI等于1表示每个异常精于只有一种缺陷，TZI等于3则表示每个异常精子都有头部、中段和尾部缺陷。所以，TZI反映的是每个精子的缺陷程度，是针对每个精子个体而言，而精子密度、活动率、前向活动率和正常形态以及SDI是就每一份精液的整体而言。

畸形精子指数的数值介于1.00和3.00之间。以前的报道提示，TZI1.6与未经治疗不育夫妇的低生育率有关，而且SDI=1.6是体外受精失败的阈值。这些参数预示精子在体内和体外的功能情况。

例：使用六键计数器每次计数200条精子。在第1次计数时，42条正常158条异常。在158条异常精子中，140条有头部缺陷，102条有颈部缺陷，30条有尾部缺陷，44条有多余的胞浆小滴残留。在第2次计数时，36条正常，164条异常。其中122条有头部畸形，22条颈部畸形，36条有多余的胞浆小滴。计算TZI时，用总的畸形数(140+102+30+44+122+108+22+36=604畸形)除以异常精子数(158+164=322),TZI=604/322=1.88；SDI=604/400=1.51。

计算机辅助精子形态学计量分析的优势

CASA的影像分析使精子形态学分析评估量化，能获得更多的精子特征参数。

自动分析系统比手工操作具有更好的客观性、精确性和可重复性，变异系数＜7%,甚至比熟练的操作人员更精确。

面对门诊量巨大，人力不足的情况，还要把精子形态学分析列为常规检查，同时执行严格的质控措施，确实有许多困难。使用CASA是最好的出路（可任意选择15%标准或4%标准）。