食品中动物源性成分定性检测.docx

食品补充检验方法

BJS202401

食品中动物源性成分定性检测

2024-12-22发布

国家市场监督管理总局发布

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BJS202401

食品中动物源性成分定性检测

1范围

本方法规定了食品中动物源性成分的检测方法。

本方法适用于食品中可能含有的一种或者多种哺乳类、禽类、鱼类等动物源性成分的高通量测序定性检测。

可鉴别动物物种列表见附录A。本方法检出限为1%(质量分数)。

2原理

针对动物线粒体基因(mtDNA)的相对保守片段设计通用PCR引物,将扩增片段与数据库比对,确定所属动物物种,实现样品中动物源物种成分的定性检测。

3试剂和材料

除另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

3.1引物

引物序列见表1。

表1引物序列

引物类型

引物序列

片段大小

基因名称

上游引物下游引物

5》-adapter-GGTAAAWYTYGTGCCAGCCA-3》

5》-adapter-GCATAGTGGGGTATCTAATCCYAG-3》

20bp24bp

12SrRNA12SrRNA

注:表中含简并碱基,其中碱基W代表碱基A/T,碱基Y代表碱基C/T。adapter表示接头,为一段短核苷酸序列,用于连接目标测序片段。

3.2试剂

3.2.1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,C19H42BrN)。

3.2.2氯化钠(NaCl)。

3.2.3乙二胺四乙酸二钠盐(Na2-EDTA,C10H16N2O8Na2)。

3.2.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris●HCl,C4H11NO3●HCl)。

3.2.5盐酸(HCl):4mol/L。

3.2.6苯酚(C6H6O)。

3.2.7三氯甲烷(CHCl3)。

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3.2.8异戊醇(C5H12O)。

3.2.9无水乙醇(C2H6O)。

3.2.10异丙醇(C3H8O)。

3.2.11琼脂糖(C24H38O19),电泳级。

3.2.12DNA电泳分子量标准品:50bP~500bP。

3.2.13蛋白酶K:20mg/mL。

3.2.14文库集纯化磁珠。

3.2.15PCR扩增预混液:包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、镁离子、dNTP、PCR稳定剂和增强剂。

3.2.16文库构建试剂盒:至少包含连接头、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、缓冲液。

3.2.17高通量测序试剂盒:至少包含测序引物、高通量测序反应酶、缓冲液。

3.2.182%琼脂糖凝胶:含SYBRSafe染料。

3.3试剂配制

3.3.1CTAB裂解液:称取4.00gCTAB,16.38gNaCl,1.50gNa2-EDTA,3.13gTris●HCl,用适量水溶解后,调节PH至8.0,定容至200mL。

3.3.2苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1,体积比):将苯酚、三氯甲烷、异戊醇按25:24:1的体积混合均匀。

3.3.3TE缓冲液(Tris●HCl,EDTA缓冲液):10mmol/LTris●HCl(PH8.0),1mmol/LNa2-EDTA(PH8.0)。移液器移取1molTris-HCI(PH8.0)1mL,0.5molNa2-EDTA(PH8.0)0.2mL,纯水定容至100mL。

3.3.470%乙醇(70:30,体积比):将无水乙醇、水按70:30的体积混合均匀。

4仪器和设备

4.1测序仪器

高通量基因测序仪:测序质量Q30(QualityValue,v=30)95%,序列读长≥200bP。

4.2设备

4.2.1组织均质器。

4.2.2电子天平:感量0.01g。

4.2.3高速冷冻离心机:最大转速≥12000r/min。

4.2.4恒温水浴装置,99℃±1℃。

4.2.5