DB33T 2254-2020 猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒 双重荧光定量 RT-PCR 检测方法　　.docxVIP

ICS65.020.30B41

DB33

浙江省地方标准

DB33/T2254—2020

猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法

MethodofduplexfluorescencequantitativeRT-PCRforthedetectionofporcineepidemicdiazhangchenrrheavirusandtransmissible

gastroenteritisvirus

2020-04-08发布2020-05-08实施

浙江省市场监督管理局发布

DB33/T2254—2020

I

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由浙江省农业农村厅提出。

本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：浙江农林大学。

本标准主要起草人：宋厚辉、邵春艳、王晓杜、孙静、姜胜、周莹珊、杨永春、程昌勇、章先、杨杨、卫芳芳。

DB33/T2254—2020

1

猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）双重荧光定量RT-PCR检测方法的材料准备、样品采集、核酸提取、荧光定量RT-PCR检测及结果判定。

本标准适用于猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct值：达到阈值的循环数（Cyclethreshold）DEPC：焦磷酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）

PEDV：猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus)RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirus）

4试剂和材料

4.1除非另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。0.01mol/LPBS和DEPC水配制中所使用的水应符合GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。

4.2Trizol：RNA抽提试剂，2℃~8℃保存。

4.3氯仿：2℃~8℃预冷。

4.4异丙醇：2℃~8℃预冷。

4.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，2℃~8℃预冷。

4.6DEPC水：配置方法见附录A。宜直接购买商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。

4.70.01mol/LPBS，pH7.2：配制方法见附录A。

DB33/T2254—2020

2

4.82×OneStepRT-PCRbuffer（内含PCRbuffer、dNTPs和Mg2+）。

4.9DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。

4.10反转录酶预混物（内含RNase抑制剂）。

4.11阳性对照：猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎灭活病毒混合物。

4.12阴性对照：DEPC水。

4.13用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmol/L，探针浓度10μmol/L，其序列分别为：PEDV上游引物F：5’-GCTTGCTTCGGACCCAGAGG-3’；

PEDV下游引物R：5’-ACGAACAGCCACATTACCACCAA-3’；

PEDV探针P：5’-TTGGAGATGCGGAATTTGTCGAA-3’，其5’端