第8章 高效液相色谱课件.ppt

***8高效液相色谱第8章高效液相色谱8.1概述8.2HPLC仪器包括：高压输液装置;进样系统;分离系统;检测系统;辅助系统8.3流动相和固定相简介8.4高效液相色谱方法简述分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱8高效液相色谱8.1概述高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液-液分配色谱；吸附色谱(液-固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm,长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200?m范围内。即使这样，流速仍然很低(1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10?m）！8高效液相色谱1.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。2.HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途！8高效液相色谱3.应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量8高效液相色谱8.2HPLC仪器HPLC仪器包括：高压输液装置;进样系统;分离系统;检测系统;此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。其工作过程如图所示。8高效液相色谱He储液瓶分布器过滤2?m高压泵入口检查出口检查脉流消除抽气过滤器反压调节压力计注样阀分离柱到检测器HPLC仪器详解8高效液相色谱1.高压输液系统（150～350×105Pa）1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2?m，可防止颗粒物进入泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。8高效液相色谱马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成或极性（从而改变分配比k值）的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合