实验二植物体内硝酸还原酶活力的测定.pptVIP

实验二植物体内硝酸还原酶活力的测定植物生物学实验-植物生理部分NO3-和NH4+是能被植物利用的最主要的氮源。在一般田间条件下，NO3-是植物吸收的主要形式。硝酸盐的还原硝酸盐硝酸还原酶亚硝酸盐氨亚硝酸还原酶硝酸还原酶是一种诱导酶，在植物体内本来不含有，但在特定外来物质的如NO3-诱导下可以生成硝酸还原酶。【实验原理】硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：NO3-+NADH+H+NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。NR生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以单位时间内每克鲜重含氮量表示，即以μg/g/h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。【实验材料】小麦的新鲜叶片（诱导组和非诱导组）【实验器材】冷冻离心机；⑵分光光度计；⑶天平(0.01g)；⑷冰箱；⑸恒温水浴；⑹研钵；⑺剪刀；⑻离心管；⑼移液管(5、2、1mL)；⑽洗耳球；⑾试管架；(12)胶头滴管。【实验步骤】标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.20μg/mL的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度（μg/mL）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（r）建立回归方程。管号1234567试剂取量mL亚硝酸钠标准液00.10.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.90.80.60.40.201%磺胺22222220.2%萘基乙烯胺2222222每管亚硝态氮浓度μg/mL00.020.040.080.120.160.20酶的提取称取0.5-1g鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎置冰箱冰冻30min，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，洗研钵2-3次，将液体转入离心管中，共用提取液6mL，4℃8000rpm离心15min，上清液即为粗酶提取液。酶反应取4个10mL离心管，按照下表所列进行操作，混匀，25℃保温30min。终止反应和比色测定30min后立即加入lmL磺胺溶液终止酶反应，再加lmL萘基乙烯胺溶液，显色30min后于4000rpm离心5min，取上清液在540nm下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（μg/mL）。反应底物酶反应管粗酶液/mL0.1mol/LKNO3磷酸缓冲液/mLNADH溶液/mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液/mL非诱导－对照1.01.600.2非诱导－实验1.01.60.20诱导－对照1.01.600.2诱导－实验1.01.60.20