非洲猪瘟病毒MGF360-4L蛋白与宿主互作蛋白的筛选与鉴定.pdf

摘要

非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus，ASFV）是家猪和野猪患非洲猪瘟

（AfricanSwineFever，ASF）的病原。ASF是一种急性、出血性、烈性传染病，以高

热、呼吸困难、内脏器官严重出血为特征，病程时间短，病死率高，给养猪行业造成

了极大的危害。

ASFV结构复杂，能编码160多种蛋白质，各种蛋白与病毒的复制和代谢等密切

相关。但仍有许多蛋白的功能尚不明确。多基因家族（MultiGeneFamily，MGF）蛋

白是ASFV中一大类功能不明的蛋白。其中，MGF360被认为能影响宿主的免疫反应，

提高病毒的复制能力。虽然有部分研究表明，MGF360-10L、11L、12L、13L、14L基

因与病毒毒力相关，但多基因家族中每单个MGF蛋白的功能及与宿主蛋白质之间的

互作却不尽相同。目前仍没有针对MGF360-4L基因的相关研究，因此本实验采用酵

母双杂交技术，探究ASFVMGF360-4L与宿主蛋白之间的相互作用，为阐明ASFV

的致病机理提供一定的理论基础。

本文主要研究内容包含三个方面：

（1）ASFVMGF360-4L蛋白诱饵质粒的构建及相关性检测

以实验室合成的II型ASFV毒株的基因组DNA为模板，扩增MGF360-4L基因

片段，构建重组诱饵表达质粒pGBKT7-MGF360-4L，并转化到Y2HGold中，对诱饵

表达载体进行细胞毒性、自激活及蛋白融合表达三方面检测。含pGBKT7-MGF360-4L

的SD/-Trp培养板与空载体pGBKT7培养板上生长的菌落数量基本一致，菌落大小相

同，说明诱饵质粒pGBKT7-MGF360-4L不存在细胞毒性。含pGBKT7-MGF360-4L

的酵母菌在SD/-Trp/X-α-Gal的培养板上呈白色，且无法在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA上生

长，说明MGF360-4L对酵母菌不存在自激活现象。Westernblot检测诱饵蛋白

MGF360-4L能与BD结构域融合后正常表达，条带大小正常，符合预期。

（2）猪肺巨噬细胞cDNA文库构建及甘油菌制备

为构建猪肺巨噬细胞cDNA文库，获取猪肺巨噬细胞后提取总RNA，合成cDNA，

并与pGADT7进行重组，转化至大肠杆菌感受态细胞，提取文库质粒。将质粒转化到

Y187感受态中，制备文库甘油菌，用于后续杂交实验。构建的cDNA文库容量为

67

2.3×10CFU/mL。制备的文库甘油菌容量为7.9×10CFU/mL。挑取24个Y187酵母

I

菌进行PCR鉴定，发现其中23个插入片段在300～2000bp之间，转化后的有效率为

95.8％，符合实验要求。

（3）酵母双杂交筛选与MGF360-4L相互作用宿主蛋白

利用酵母双杂交方法将诱饵质粒MGF360-4L与cDNA文库进行筛选，经过

SD/-Trp/-Leu/-Ade、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba培养

板的三轮筛选后，得到95个蓝色克隆，PCR鉴定后测序，BLAST比对后发现存在有

锌指蛋白461、EF-hand含钙结合结构域蛋白11（EFCAB11）、A3Z2_1、cGMP抑制

的3,5-环磷酸二酯酶A（PDE3A）、ATP结合盒转运A10（ABCA10）等7种与ASFV

MGF360-4L存在互作的候选蛋白，并初步验证了锌指蛋白461与MGF360-4L存在相

互作用，为进一步研究ASFV的致病机理提供理论依据。

关键词：非洲猪瘟病毒；MGF360-4L；酵母双杂交；cDNA文库

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