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猪圆环病毒3型聚合酶链式反应检测方法

1范围

本标准规定了猪圆环病毒3型（PorcineCircovirusType3，PCV3）的聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）试验方法。

本标准适用于猪圆环病毒3型的快速诊断、检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3原理

聚合酶链反应或多聚酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR），又称无细胞克隆技术，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上。每完成一个循环需2min～4min，2h～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

4试剂和材料

4.1水：GB/T6682，一级水。

4.2蛋白酶K溶液（20mg/mL）：配制见附录A.1。

4.310%十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）：配制见附录A.2。

4.4Tris平衡酚。

4.5三氯甲烷。

4.6无水乙醇。

4.770%乙醇：配制见附录A.3。

4.80.5×TBE缓冲液：配制见附录A.4。

4.9电泳级1%琼脂糖：配制见附录A.5。

4.10DNA核酸染料。

4.11DNAMarker2000。

4.12引物：

——P1：5’-TACCACAGAAGGCGCTATGTCG-3’；

2

——P2：5’-ATCCGCATAAGGGTCGTCTTGC-3’。

5仪器设备

5.1电子天平：感量为0.001g。

5.2微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL）。

5.3低温高速离心机。

5.4PCR仪。

5.5稳流稳压电泳仪。

5.6水平电泳槽。

5.7凝胶成像系统。

6样品

6.1样品采集

按NY/T541—2016无菌采集血清或猪淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织。

6.2样品处理

6.2.1血清直接用于DNA提取。

6.2.2淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织各1g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1:5倍稀释，取悬液反复冻融3次，5000g离心15min，取上清液-20℃保存备用。

7操作步骤

7.1病毒DNA的提取

7.1.1取上清液（或血清）500μL加入10%SDS溶液50μL、20mg/mL蛋白酶K溶液10μL，于55℃水浴2h～3h。

7.1.2加入200μLTris平衡酚，混匀，4℃12000g离心15min

7.1.3取上清液500μL，加入200μLTris平衡酚和200μL三氯甲烷，4℃12000g离心15min。

7.1.4取上清液400μL，加入200μL三氯甲烷，4℃12000g离心15min。

7.1.5取上清液300μL，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min，4℃12000g离心15min。

7.1.6弃上清液，加入1mL70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。

7.1.7加入20μL灭菌一级水溶解沉淀，-20℃保存备用。

7.2聚合酶链式反应（PCR）操作流程

7.2.1PCR反应体系配制

按表1中1-7的循序配制。

表1聚合酶链式反应体系

1

10×反应缓冲液

5.0μL

2

dNTP混合液(10mmol/L)

4.0μL

3

表1聚合酶链式反应体系（续）

3

P1(10μmol/L)

1.0μL

4

P2(10μmol/L)

1.0μL

5

DNA

4.0μL

6

TaqDNA聚合酶(8U/μL)

1.0μL

7

灭菌水

补足至总体积50.0μL

7.2.2PCR程序设定

每次PCR均应设一个阳性对照和阴性对照