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猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR的检测方法。

本标准适用于猪圆环病毒2型与3型的核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct值：达到阈值的循环数（Cyclethreshold）

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSolution）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

PCV-2：猪圆环病毒2型（PorcineCircovirus2）

PCV-3：猪圆环病毒3型（PorcineCircovirus3）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

4试剂和材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯；灭菌水，0.01mol/LPBS和8mmol/LNaOH配制中所使用的水应符合GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。

4.1DNAzolReagent：DNA抽提试剂，2℃~8℃保存。

4.2无水乙醇：4℃预冷。

4.375%乙醇：用无水乙醇和灭菌水配制，-20℃预冷。

4.48mmol/LNaOH溶液：配制方法见附录A。

4.50.01mol/LPBS，pH7.2：配制方法见附录A。

4.62×PremixHSTaq（内含PCRbuffer，HSTaq，dNTPs，Mg2+，RNaseH等）。

4.7阳性对照：猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪圆环病毒3型阳性克隆质粒。PCV-3目的基因（ORF2）序列见附录A。

4.8空白对照：灭菌水。

4.9用于荧光定量PCR的引物浓度为10μmol/L，Taqman探针浓度5μmol/L，其序列分别为：——PCV-2-F：5’-TCACCTATGACCCCTATG-3’；

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——PCV-2-R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’；

——PCV-2-P：5’-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1-3’；

——PCV-3-F：5’-TGGCTCAACACATATGAC-3’；

——PCV-3-R：5’-ACGGACTTGTAACGAATC-3’；

——PCV-3-P：5’-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1-3’。

4.10一次性耗材：乳胶手套、1.5mL离心管、15mL离心管、荧光PCR反应管和吸头。

5器材和设备

5.1电热干燥箱。

5.2高压灭菌锅。

5.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃,最大离心速度可达12000r/min以上。

5.4冷藏冰箱，超低温冰箱（-80℃)。

5.5荧光PCR检测仪。

5.6组织匀浆器。

5.7移液器。

5.8研钵。

6实验室分区

检测实验室应有相应的生物安全设施和功能分区，包括样品处理区、核酸提取区、试剂配制区和扩增区。各功能区有专用的试剂和实验材料，不可交叉使用。

7样品的采集与处理

7.1采样注意事项

采样及样品前处理过程中应注意无菌操作，防止样本交叉污染。

7.2采样工具

药匙、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h。

7.3采样方法与处理

7.3.1内脏样品

采取病死或剖杀猪的主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏）装入15mL灭菌离心管中，按1：4倍体积加入灭菌的0.01mol/LPBS。运送至实验室后，再用研钵或组织匀浆器对组织进行充分研磨混匀，反复冻融3次。在4℃条件下以3000r/min离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。

7.3.2血清样品

血清样品无需处理，直接用于核酸提取。

7.4存放与运送

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采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6h～8h之内运送到实验室。采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h；需长期保存时，应放置-80℃冰箱，但应避免反复冻融