猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术.docxVIP

1

猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术

1范围

本标准规定了猪圆环病毒2型(PCV2)荧光PCR检测技术的要求。

本标准适用于猪血清和组织中猪圆环病毒2型的检测。

2材料

2.1器材

2.1.1微量移液器(最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL)

2.1.220000g高速冷冻离心机

2.1.3紫外分光光度计

2.1.4PCR仪

2.2荧光定量PCR仪试剂

2.2.1质粒提取试剂盒

2.2.2SYBRGreenⅠ核酸染料

2.2.3凝胶回收试剂盒

2.2.4蛋白酶K(见附录A.1章)

2.2.510%SDS液（见附录A.2章）

2.2.670%乙醇（见附录A.3章）

2.2.71%琼脂糖凝胶（见附录A.4章）

2.2.8DNAMarker2000

2.3引物

Y1：5’-GCTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTT-3’

Y2：5’-GAGTGGGCTCCAGTGCTGTTAT-3’

3方法

3.1质粒标准阳性模板的制备

3.1.1质粒的构建及鉴定

利用普通PCR技术扩增出PCV2的ORF2基因702bp片段,凝胶回收后克隆到克隆载体。纯化质粒，并转化DH5α感受态细胞，挑选转化长出的菌落进行培养，提取质粒进行PCR鉴定。

3.1.2重组质粒浓度的测定

将阳性重组质粒作20倍稀释，用紫外分光光度计测定其浓度，并计算标准品的拷贝数。3.1.3标准品制备

将重组质粒稀释至1.0×1010拷贝/μL后再倍比稀释，分别以109、108、107、106、105拷贝/μL5个梯度作为标准品模板，-70℃保存备用。

2

3.2病毒基因组的提取

对病料用蛋白酶K裂解法提取总DNA。

3.2.1病料处理：取小块病料组织于研钵中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研磨。

3.2.2取研磨液500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL，加入10%的SDS溶液25μL，55℃水浴2-3h。

3.2.3加入200μLTris饱和酚，充分混匀，10000g离心15min。

3.2.4取上清于一新的离心管中，加入200μLTris饱和酚和200μL氯仿，10000g离心15min。3.2.5取上清于一新离心管中，加入200μL氯仿，10000g离心15min。

3.2.6取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静止20min，10000g离心15min，弃上清。

3.2.7加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。

3.2.8加入100μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。

3.3荧光定量PCR体系，详见表1。

表1荧光定量PCR反应体系

步骤1

SYBRGreenⅠ核酸染料

12.5μL

步骤2

引物Y1

1.0μL

步骤3

引物Y2

1.0μL

步骤4

DNA

2.0μL

步骤5

超纯水

8.5μL

总量

25.0μL

荧光定量PCR程序设定

每次PCR均应设一个阴性对照，具体参数见表2。

表2荧光定量PCR反应程序设定

温度

时间

步骤1

95℃

3min

步骤2

95℃

10s

59℃收集信号

10s

步骤3

95℃

2min

60℃

20s

95℃

Continue

4结果判定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。

4.1标准曲线

选择109、108、107、106、105拷贝/μL5个梯度浓度的质粒作为模板，制作出动力学曲线和标准曲线。建立的标准曲线斜率为-3.304，轴截距为39.051，线性方程为Y=-3.394X+39.051，相关系数为0.994。

荧光定量PCR能检测出的模板最低浓度为10拷贝/μL，而且不能扩增出PCV1、PPV、PRV病毒DNA，有很好的特异性。

4.2质控标准

3

4.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。

4.2.2阳性对照Ct值≤35，并出现特定扩增曲线。否则，则此试验视为无效。

4.3结果描述及判定

4.3.1阴性

无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无PCV2病毒。

4.3.2阳性

Ct值≤35，且出现特定扩增曲线，表明样品中存在PCV2病毒。

4.3.3有效原则

Ct值﹥35的样品须重做，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。

4

附录A

（规范性附录）

试剂的配制

A.1蛋白酶K溶液(20mg/mL)

蛋白酶K

10