目的基因的表达.pptVIP

酿酒酵母中外源基因的表达01第一个用于生产重组蛋白的酵母为酿酒酵母（S.cerevisiae）。要在酵母中最大限度表达基因，需要特异的启动子（乙醇脱氢酶、同工酶-Ⅰ、磷酸甘油激酶、酸性磷酸酶和α因子等基因的启动子）。02通过重组DNA技术，可以利用酿酒酵母生产医用的外源蛋白。用酵母生物技术方法得到的第一种医用产品是乙型肝炎疫苗。其他类似产品包括组织型血纤维蛋白溶源激活因子、胰岛素和水蛭素。酵母生产外源蛋白的最佳表达盒包括有效的启动子序列（可为诱导性或组成性），目的蛋白cDNA和转录终止序列。由于酿酒酵母不能识别和处理高等真核内含子，因而须使用cDNA。01020304启动子和终止子的选择；表达盒的稳定性；外源蛋白的累积部位；产量的提高。使用酿酒酵母表达系统需考虑问题：甲醇酵母中外源基因的表达甲醇酵母，如Pichiapastoris和Hansenulapolymopha，既保持了酿酒酵母的优点，还能大幅度提高产量，部分解决了糖基化问题，能在简单的培养基上利用甲醇为惟一碳源。0102在甲醇中生长时，这些酶约占细胞蛋白总量的30％。表达AOX/MOX的强大可调控启动子已用于生产重组蛋白。其表达框能够与宿主整合，并在非选择生长时保持稳定。02在利用甲醇路径中，第一个用在P.pastoris中的酶为乙醇氧化酶(AOX)，在H.ploymorpha中为甲醇氧化酶(MOX)，而且AOX/MOX表达为高度调控的，完全诱导都需要甲醇的存在。01P.pastoris表达载体包括AOX启动子、AOX序列、AOX终止序列，其中的多个克隆位点供外源基因插入，以组氨酸脱氢酶基因(HIS4)为互补性筛选标志，还包括部分pBR322质粒序列，使之成为在大肠杆菌中繁殖的穿梭质粒。将表达载体酶切后线性化，整合于酵母基因组AOX或HIS4基因位置，可随酵母生长稳定地存在。甲醇酵母能大量分泌异源蛋白，对质粒也能发生高频整合，用一系列方法可增加拷贝数，提高产量。12在转译异源蛋白时，遗传和转译的稳定性常受影响，如点突变等。点突变可通过大量的基因拷贝数解决，原因是突变会被大量的正常基因覆盖掉。01转译产物不稳定，可利用蛋白酶缺陷型菌株来解决，防止产物降解。02三．酵母表达外源基因的缺陷和解决方法转译错误可通过对DNA修改来防止，如选用酵母合适的密码子以避免错误地插入tRNA和由于使用酵母中稀有密码子而引起的转译中断和移位，以提高正确的产物产量。要得到有活性的成熟产物，选择转译后具修饰能力的酵母及合适的载体。生产分泌蛋白时，能够糖基化和形成二硫键，而且能在信号肽的引导下进行分泌，但用KEX2蛋白酶除去α-因子的前导肽序列常不够完全，导致分泌蛋白有一个过长的氨基酸末端。可采用氨基末端间隔序列解决，在α-因子的前导肽序列和产物之间加1个间隔序列，这个间隔序列肽可在体外或体内用特异蛋白酶或酵母天冬氨酰蛋白酶切除。酵母能进行N-糖基化，但主要是甘露糖型；还会发生过糖基化，而这样的糖基化会导致潜在免疫性。改变表达宿主糖基化背景能使产生的糖蛋白符合要求，但由于每种糖蛋白糖基化都不同，因而要分别测试所要表达的各种临床中使用的糖蛋白。6）糖基化大肠杆菌表达系统的特点大肠杆菌表达融合蛋白大肠杆菌细胞包含体提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径对于外源基因（尤其是真核基因），利用融合表达的方法在大肠杆菌中表达有很多优点：由于外源基因一般是被连接到可供融合的蛋白的C端编码序列之后，因此不需另外设计SD序列，同时，N端融合基因的存在，使得外源基因的表达相对比较容易。外源基因的表达产物常常会被宿主细胞的蛋白酶所降解，当外源基因与宿主本身的某种蛋白(如β-半乳糖苷酶)的部分编码序列构成融合基因，以融合蛋白的形式表达时，往往会减低宿主细胞对产物的降解。通过融合表达为蛋白纯化提供便利：将外源目的基因与一段“亲和手柄”的编码序列相连接，这段“亲和手柄”可以与亲和层析柱上的配基特异性地结合，这样所表达的融合蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。所得到的融合蛋白经化学方法或酶法切割开来之后，混合产物再上同一亲和柱，充作“亲和手柄”的一段多肽或蛋白以及尚未被切开的融合蛋白被吸附于柱上，而重组目的产物则处于流动相中。这样，经过比较简单的几步即得到较高纯度的重组目的蛋白。1融合蛋白是避免细菌蛋白酶破坏的最好措施。32通过融合表达使产物以可溶性的方式表达。通过融合表达的方式促使产物以包含体的形式表达，产物表达量往往比较高。大肠杆菌表达系统的特点大肠杆菌表达融合蛋白大肠杆菌细胞包含体提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径12某些目的蛋白在大肠杆菌的表达形式是细胞内的